張明多 閆云峰 莊須翠 張玉慧 王爭(zhēng)明 李德鵬 李麗琴 宋現(xiàn)濤 呂樹錚

趙全明

研究表明，炎癥貫穿動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展的全過程[2]。噻唑烷二酮類(thiazolidinediones, TZDs)藥物可能通過抗炎發(fā)揮降低血栓事件率的作用[3]。TZDs是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)激活劑，不僅可以調(diào)節(jié)血糖濃度，而且它還能抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。核素分子成像是一種功能和代謝成像方式，能夠檢測(cè)出病變組織炎癥，目前已用于動(dòng)脈粥樣硬化領(lǐng)域的研究。氟代脫氧葡萄糖(18F-FDG)PET/ CT在獲得功能代謝顯像數(shù)據(jù)的同時(shí)又可獲得形態(tài)學(xué)的資料，使得PET/CT應(yīng)用于斑塊炎性程度及抗炎藥物治療效果評(píng)估成為可能。本實(shí)驗(yàn)以改良的康斯坦丁兔為動(dòng)脈粥樣硬化和易損斑塊動(dòng)物模型，吡格列酮對(duì)模型進(jìn)行干預(yù)，以PET/CT作為監(jiān)測(cè)工具, 探討吡格列酮是否具有降低斑塊破裂率，改善斑塊易損性的作用及可能機(jī)制。

材料與方法

1.動(dòng)物模型 20只雄性新西蘭大耳白兔(北京市海淀區(qū)興旺動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK(京)2006-0006)，動(dòng)物體質(zhì)量約(3.0±0.5)kg。抽簽法隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(n=10)和藥物組(吡格列酮，n=10)。兩組給予高脂飼料喂養(yǎng)2周后, 用改良的Phinikaridou方法[6]行主動(dòng)脈內(nèi)膜球囊拉傷術(shù)制作動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型。此后對(duì)照組動(dòng)物給予間斷高脂飼料喂養(yǎng)16周，藥物組動(dòng)物在高脂飼料的基礎(chǔ)上服用吡格列酮(10 mg·kg-1·d-1)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)條例規(guī)定。

2.破裂誘發(fā)實(shí)驗(yàn) 兩組動(dòng)物于球囊拉傷術(shù)后第16周 (蛇毒0.15mg/kg腹膜下注射30min后，經(jīng)兔耳緣靜脈注射組胺0.02 mg/kg) 間隔24h，進(jìn)行2次藥物誘發(fā)斑塊破裂實(shí)驗(yàn)。

318F-FDG PET/CT顯像及影像融合 共進(jìn)行二次PET/CT掃描：第一次于喂養(yǎng)第8周球囊拉傷術(shù)后造模完成時(shí)(實(shí)驗(yàn)中期掃描)；第二次于第18周藥物誘發(fā)試驗(yàn)前(實(shí)驗(yàn)晚期掃描)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于顯像前夜禁食、水。顯像當(dāng)日根據(jù)體重予以靜脈麻醉(3%的戊巴比妥鈉，劑量為1～1.5mL/kg)。再分別經(jīng)靜脈予以18F-FDG，劑量為1mCi/kg。給藥后180分鐘后將兔仰臥位固定于兔臺(tái)上進(jìn)行普通CT定位平掃，后PET三維圖像采像10min。完成后以歐乃派克10mL(按照1∶1稀釋) 0.4mL/s進(jìn)行CT血管造影掃描(160mA,120kV)。將PET圖像和CT圖像在PET/CT后處理工作站中利用軟件進(jìn)行圖像融合，并測(cè)量各層面顯影動(dòng)脈的不同節(jié)段的FDG標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(standard uptake value，SUV)。具體方法是參照主動(dòng)脈上左腎動(dòng)脈起始部，分別向上下方標(biāo)記，每3.75mm為一層面，向上至主動(dòng)脈弓，向下至髂動(dòng)脈分叉，根據(jù)主動(dòng)脈直徑，劃定包含全部主動(dòng)脈橫斷面的圓形感興趣區(qū)域，由工作站軟件根據(jù)注射18F-FDG劑量，代謝時(shí)間和動(dòng)物體質(zhì)量自動(dòng)生成所選區(qū)域的平均標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmean)和最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmax)。進(jìn)行SUV后期統(tǒng)計(jì)時(shí)，每相鄰兩個(gè)層面SUVmean的平均值代表每一動(dòng)脈段標(biāo)本的SUVmean，每兩個(gè)層面SUVmax的較大者代表每一動(dòng)脈段標(biāo)本的SUV max。

4.離體標(biāo)本病理染色及組織學(xué)測(cè)量 PET/CT活體顯像完成后，注射過量的戊巴比妥鈉處死試驗(yàn)動(dòng)物。參照主動(dòng)脈上左腎動(dòng)脈起始部為標(biāo)志，由上到下方向每7.5mm為一節(jié)段分為若干標(biāo)本，以備病理送檢。進(jìn)行離體標(biāo)本的大體病理觀察和記錄后，將每一長度為7.5mm的兔主動(dòng)脈標(biāo)本垂直于動(dòng)脈橫截面方向分為兩個(gè)各為均分為3.75mm的節(jié)段留取標(biāo)本，對(duì)所有動(dòng)脈段進(jìn)行石蠟包埋切片以及 HE 染色 巨噬細(xì)胞 RAM-11 染色以及新生血管 CD-31免疫組化染色。

5.病理學(xué)分析 使用NIS-Elements AR Analysis病理圖像分析系統(tǒng)采集圖像，利用該軟件分別測(cè)量每一載玻片上動(dòng)脈段中內(nèi)斑塊面積及血栓形成情況。其中斑塊面積=內(nèi)彈力膜構(gòu)成的環(huán)形面積-管腔面積。血栓形成情況的計(jì)算：以1.5cm將所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主動(dòng)脈進(jìn)行分段，分別計(jì)算藥物組和對(duì)照組中血栓形成的動(dòng)脈段數(shù)量，未形成血栓的動(dòng)脈段數(shù)量。圖像采用NIS-Elements AR Analysis軟件測(cè)量斑塊內(nèi)陽性細(xì)胞積分光密度值及內(nèi)膜面積積分值，并計(jì)算巨噬細(xì)胞密度值(巨噬細(xì)胞密度值=陽性細(xì)胞積分光密度值/內(nèi)膜面積積分值)。然后計(jì)算每只動(dòng)物巨噬細(xì)胞密度的平均值。計(jì)算整個(gè)血管壁10×10倍視野內(nèi)新生血管數(shù)量，然后計(jì)算每只動(dòng)物新生血管數(shù)量的總和。

6.血脂及炎癥因子檢測(cè) 于第8 周、18 周抽取血液樣本，用生化試劑盒檢測(cè)血糖、血脂、hs-CRP，用ELISA試劑盒檢測(cè)血清MMP-9。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 16.0軟件包。Levene’s 檢驗(yàn)驗(yàn)證方差齊性，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用數(shù)量或百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況 參與實(shí)驗(yàn)的20只動(dòng)物中，共有13只動(dòng)物在最終的安樂死前死亡，其中藥物組死亡6只，對(duì)照組死亡7只。在實(shí)驗(yàn)的20只動(dòng)物中，3只動(dòng)物在球囊拉傷腹主動(dòng)脈手術(shù)過程中死亡。高脂飼料喂養(yǎng)過程中，5只死于高膽固醇血癥、肝中毒，2只死于嚴(yán)重營養(yǎng)不良并發(fā)感染。藥物誘發(fā)過程中，2只死于肺水腫。1只死于急性血栓閉塞。共8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(藥物組4只，對(duì)照組4只)進(jìn)行了病理分析，7只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(藥物組4只，對(duì)照組3只)于第二次PET/CT顯像后處死，病理結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)藥物組4只動(dòng)物有血栓形成；對(duì)照組3只動(dòng)物有血栓形成。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生化檢測(cè)結(jié)果

注：MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；與基線相比，*P<0.05；與對(duì)照組相比，?P<0.05

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清學(xué)分析結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果見表1。基線數(shù)據(jù)顯示藥物組及對(duì)照組兩組間和組內(nèi)空腹血糖、胰島素、TC、TG、hs-CRP及MMP-9檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高脂喂養(yǎng)18周后，對(duì)比基線水平，藥物組及對(duì)照組血清TC均有顯著提高。藥物組及對(duì)照組血清MMP-9水平也均有顯著提高。藥物組MMP-9顯著低于對(duì)照組MMP-9水平。藥物組高敏CRP也顯著低于對(duì)照組hs-CRP水平。治療后兩組間TC水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組間體質(zhì)量、血清胰島素及血糖均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果提示高脂喂養(yǎng)能促進(jìn)兔動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，吡格列酮干預(yù)能降低血清MMP-9濃度。

3.18F-FDG PET/CT體外活體顯像及影像融合 中期掃描如圖1所示，藥物組CTA可見動(dòng)脈管壁光滑，管腔未見充盈缺損，PET圖像未見明顯放射性濃聚，PET/CT融合圖像顯示更加直觀明確(圖1A)。對(duì)照組CTA可見動(dòng)脈管壁略不規(guī)則，管腔可見少量充盈缺損，但水平位CTA上未見明顯充盈缺損；冠狀位及水平位PET圖像及PET/CT融合圖像上可見少量放射性攝取，提示早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成(圖1B箭頭處所示)。晚期掃描如圖3所示，藥物組與中期掃描比較類似，血管均較正常(圖2A)。對(duì)照組主動(dòng)脈管壁走形不規(guī)則，管腔有不同程度的狹窄，造影上可見造影劑有明顯的偏心性充盈缺損，提示有血栓形成；PET圖像中可見局灶性放射性攝取，融合后的PET/CT圖像可直觀明確地顯示主動(dòng)脈區(qū)有充盈缺損和放射性攝取(圖2B箭頭處所示)。

4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18F-FDG攝取的比較和評(píng)估 與中期掃描相比，藥物組內(nèi)晚期掃描SUVmean值明顯降低[(0.62±0.21)vs.(0.55±0.19),P=0.008]。與此相反，對(duì)照組內(nèi)晚期掃描SUVmean值明顯升高[(0.61±0.15)vs.(0.91±0.20),P<0.000]。另外，兩組間基線掃描SUVmean值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.62±0.21)vs.(0.61±0.15),P=0.523]。SUVmax值的情況和SUVmean值類似。藥物治療組SUV mean呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而對(duì)照組SUV mean呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(藥物組降低0.07±0.27；對(duì)照組升高0.31±0.28),P<0.001](圖3A)。同樣，藥物治療組與對(duì)照組SUV max改變得出了相似的結(jié)果(圖3B)。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中期掃描表現(xiàn) A：藥物組；B：對(duì)照組

圖2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物晚期掃描表現(xiàn) A：藥物組；B：對(duì)照組

圖3 藥物組及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)晚期SUV改變值對(duì)比 ΔSUV,晚期掃描減去中期掃描SUV值；A:ΔSUVmean，B:ΔSUVmax；* P<0.05

5.動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)兔主動(dòng)脈產(chǎn)生了AHA分型的各類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。其中藥物組4只，對(duì)照組3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有血栓形成。藥物組的75個(gè)主動(dòng)脈段中11個(gè)有血栓形成，對(duì)照組的51個(gè)主動(dòng)脈段中20個(gè)有血栓形成，兩組兔的動(dòng)脈斑塊血栓形成率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(15 %vs. 39 %,P=0.002)，藥物組明顯低于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，藥物組斑塊面積小[(18.00±2.30)vs.(29.00±9.30),P<0.001]、巨噬細(xì)胞密度低[(8.80±3.94)vs.(30.13±4.19),P<0.001]、新生血管計(jì)數(shù)少[(16.50±3.09)vs.(31.00±6.11),P<0.05]，均提示吡格列酮能降低斑塊的炎性細(xì)胞聚集，降低斑塊新生血管數(shù)量，增加斑塊的穩(wěn)定性(圖4～6)。

圖4 兩組間斑塊面積對(duì)比圖A:兔主動(dòng)脈HE染色顯示藥物組及對(duì)照組斑塊面積；B:兩組間對(duì)比顯示：* P<0.05，對(duì)照組具有較大的斑塊面積。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(×100)

圖5 兩組間巨噬細(xì)胞密度對(duì)比圖A:兔主動(dòng)脈RAM-11免疫組化染色顯示藥物組及對(duì)照組斑塊巨噬細(xì)胞密度：免疫組化染色后，巨噬細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞下大量聚集，位置表淺，被著色為黃棕色或褐色圓形細(xì)胞，對(duì)照組褐色深染，具有較多巨噬細(xì)胞；B:兩組間對(duì)比顯示：*P<0.05，對(duì)照組具有較大的斑塊巨噬細(xì)胞密度。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(×100)

圖6 兩組間新生血管計(jì)數(shù)對(duì)比圖A:兔主動(dòng)脈CD31免疫組化染色顯示藥物組及對(duì)照組斑塊新生血管；B:兩組間對(duì)比顯示：對(duì)照組具有較多的斑塊新生血管形成。* P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(×400)

討 論

根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)的兔主動(dòng)脈標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)分析顯示：本實(shí)驗(yàn)中兔主動(dòng)脈產(chǎn)生了AHA分類的各型斑塊。本實(shí)驗(yàn)在制造動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊以及血栓形成模型上結(jié)果比較滿意，為PET/CT監(jiān)測(cè)吡格列酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的作用及其機(jī)制的研究提供了適宜的研究對(duì)象。

眾多研究表明，以18FDG為示蹤分子的PET/CT顯像技術(shù)可用于定性和定量的檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥和評(píng)估抗動(dòng)脈硬化藥物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示動(dòng)脈18F-FDG局部聚集度和相應(yīng)部位的組織病理學(xué)切片測(cè)量的巨噬細(xì)胞密度之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。Rudd等[7]進(jìn)行的首次前瞻性臨床研究結(jié)果表明，癥狀性頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊患者局部18F-FDG攝取較對(duì)側(cè)無癥狀頸動(dòng)脈顯著升高。此外，切除的離體頸動(dòng)脈斑塊的放射自顯影證實(shí)FDG在斑塊巨噬細(xì)胞豐富的部位聚集。

在我們的研究中，我們利用PET/CT分別于實(shí)驗(yàn)中期和實(shí)驗(yàn)晚期測(cè)定兔主動(dòng)脈斑塊SUV值以對(duì)斑塊局部炎癥狀態(tài)及發(fā)展進(jìn)行評(píng)估以觀察不同實(shí)驗(yàn)階段兩組內(nèi)部兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展變化以及同一實(shí)驗(yàn)階段內(nèi)兩組間兔斑塊發(fā)展的差異。我們發(fā)現(xiàn)，中期掃描顯示對(duì)照組早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。晚期掃描顯示對(duì)照組提示有血栓形成；PET圖像中可見放射性攝取。組內(nèi)前后匹配對(duì)比：與中期掃描相比，藥物組內(nèi)晚期掃描SUV值明顯降低。與此相反，對(duì)照組內(nèi)晚期掃描SUV值明顯升高，兩組間基線掃描SUV值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物治療組SUV mean呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而對(duì)照組SUV mean呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步明確FDG攝取增加反映了炎癥程度，同時(shí)也表明，PET/CT顯像在檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥中的價(jià)值，這與先前的研究結(jié)果是一致的[8-10]。

除了定性及定量的評(píng)價(jià)斑塊炎癥， PET / CT成像還可以評(píng)估抗動(dòng)脈硬化藥物的作用。Tahara等[11]首次發(fā)現(xiàn)，低劑量的辛伐他汀能夠降低斑塊FDG攝取即降低了患者胸主動(dòng)脈連續(xù)掃描SUV攝取值。在隨后的研究[12]中，其他他汀類藥物(例如阿托伐他汀)也表現(xiàn)出類似的降低FDG攝取的效應(yīng)。Vucic等[21]研究了吡格列酮對(duì)新西蘭兔的抗炎作用，研究結(jié)果顯示：FDG攝取在吡格列酮組保持穩(wěn)定，與此相反，對(duì)照組FDG攝取顯著提高。在我們的研究中，研究結(jié)果與之前的研究結(jié)果也較為一致[13]。

我們?cè)诖搜芯恐邪l(fā)現(xiàn)：吡格列酮可以顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化兔斑塊破裂的發(fā)生率。斑塊炎癥程度的降低，F(xiàn)DG攝取值的下降，巨噬細(xì)胞密度的降低，新生血管計(jì)數(shù)的降低和血清炎癥標(biāo)記物的下降等可能是斑塊破裂率下降的部分機(jī)制。我們的研究證實(shí)了吡格列酮在降低斑塊炎癥中的價(jià)值，這與Vucic等[13]研究結(jié)果一致。此外，我們進(jìn)一步探討了研究了斑塊炎癥程度的降低是否在機(jī)制上部分程度介導(dǎo)了吡格列酮治療所引起的斑塊破裂率的降低。Patel等[14]采用依折麥布在兔模型上也得到了類似的結(jié)果，他們通過依折麥布降低斑塊負(fù)荷，結(jié)晶化和炎癥水平觀察到了斑塊破裂和血栓形成的降低。

先前的研究表明，吡格列酮治療降低炎癥標(biāo)記物的表達(dá)，如血漿中的CRP和動(dòng)脈壁的MMP-9，導(dǎo)致LDL受體基因敲除小鼠模型動(dòng)脈粥樣硬化病變體積減小和炎癥水平的降低[15-17]。在人類中，TZDs類藥物也已經(jīng)顯示出對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變的保護(hù)作用和對(duì)心血管事件的降低作用[18]。TZDs類藥物減少2型糖尿病患者循環(huán)炎癥介質(zhì)水平，包括CRP，白細(xì)胞介素6(IL-6)，CD40L，纖維蛋白原，MMP-9和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)[19]。我們的研究中也已在觀察到類似的結(jié)果，藥物組高敏CRP、MMP-9顯著低于對(duì)照組。這表明吡格列酮穩(wěn)定斑塊的作用中降低促炎癥標(biāo)志物是一個(gè)重要方面。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩組之間的血糖水平?jīng)]有顯著差異。因此，吡格列酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔的抗炎作用機(jī)制獨(dú)立于其降血糖作用，這些結(jié)果與Mizoguchi 等[20]研究一致。

PPARγ也通過諸多免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞如高度表達(dá)的巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用。有證據(jù)顯示吡格列酮可通過核因子kappa-B(NF-κB)介導(dǎo)通路降低如炎性細(xì)胞滲出等炎性反應(yīng)[20]。在我們的研究中，吡格列酮組RAM-11染色巨噬細(xì)胞密度顯著低于對(duì)照組。這也與先前的研究相一致。有研究表明，人類主動(dòng)脈新生血管與主動(dòng)脈斑塊破裂獨(dú)立相關(guān)[21]。實(shí)驗(yàn)性高膽固醇血癥豬模型冠狀動(dòng)脈新生滋養(yǎng)血管能被他汀類藥物所抑制[22]。在人類患者進(jìn)行強(qiáng)化血脂治療也可以顯著減少外膜新生血管。先前的研究已經(jīng)證實(shí)了吡格列酮對(duì)新血管形成的潛在作用。在本研究中我們的結(jié)果同樣顯示藥物組CD31標(biāo)記的新生血管計(jì)數(shù)較對(duì)照組顯著降低。

綜上所述，吡格列酮可以通過降低斑塊炎性程度以減少斑塊破裂率。PET/CT可有效進(jìn)行成像監(jiān)測(cè)及評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的炎癥程度和評(píng)估抗動(dòng)脈硬化藥物的作用。