魏麟懿 林佩蘭 王瑋 王英強(qiáng)

摘 要 雜交育種過(guò)程中的異地授粉和花期不遇問(wèn)題一直是困擾著科研工作者的難題。因此，亟需探究出一種能長(zhǎng)時(shí)間保存花粉且能較好地保留花粉活性的方法。以光果姜、珊瑚姜和紅球姜3種姜屬植物花粉為試驗(yàn)材料，篩選花粉活性最佳檢測(cè)方法、檢測(cè)花粉常溫下的活性變化并探討花粉最佳貯藏條件，以解決雜交授粉中異地授粉和花期不遇的問(wèn)題。結(jié)果表明：MTT染色法能快速檢測(cè)3種姜屬植物花粉活性；在自然狀態(tài)下，3種姜屬植物在剛開(kāi)花時(shí)花粉活性較高，花粉活性隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，光果姜花粉常溫下的放置時(shí)間較其余2種花粉時(shí)間長(zhǎng)；光果姜花粉和紅球姜花粉的最佳貯藏方法為-80℃不干燥，珊瑚姜花粉最佳貯藏方法為-80℃干燥，最佳解凍方法均為直接取出。

關(guān)鍵詞 光果姜 ；珊瑚姜 ；紅球姜 ；花粉檢測(cè) ；花粉貯藏

中圖分類(lèi)號(hào) S573+.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.07.010

Abstract The problem of ex situ pollination and different flowering time at cross breeding stage has always been an troublesome issue for the breeders. Therefore， it is very necessary to develop a method to store pollen for a longer time and to retain well the pollen viability. Pollen of Zingiber nudicarpum， Z. corallinum and Z. zerumbet were stored under various conditions to select their optimum storage conditions， and their viability was detected to observe its change at the ambient temperature to select an optimum detection method for pollen. The results showed that the pollen viability of the three species of Zingiber was tested accurately by MTT staining. Under the natural condition， the pollen viability of these three species of Zingiber was high at the initial flowering stage and decreased with time. The pollen of Z. nudicarpum were stored for a longer time than that of the other two Zingiber species under the room temperature. The best storage condition for pollen of Z. nudicarpum and Z. zerumbet was to store at -80℃， while the pollen of Z. corallinum were stored dry at -80℃. The best thawing method is to take the pollen out directly from the storage.

Keywords Zingiber nudicarpum ； Z. corallinum ； Z. zerumbet ； pollen detection ； pollen storage

姜屬（Zingiber）為多年生草本植物，約有80種，分布于亞洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國(guó)有14種，產(chǎn)于西南部至東南部[1]，大部分的姜屬植物都具有優(yōu)良的觀賞價(jià)值[2]。其中，光果姜（Z. nudicarpum）、珊瑚姜（Z. corallinum）和紅球姜（Z. zerumbet）是姜屬植物中有名的觀賞植物[2]，光果姜具有殷紅的錐形花序，珊瑚姜具有獨(dú)特的紡錘形花序[3]，紅球姜具有鮮紅色球果狀的花序[4]。若能將這3種植物成功雜交，有可能培育出具有更高觀賞價(jià)值的新品種。

這3種植物在雜交過(guò)程中存在花期不遇和異地授粉的問(wèn)題[2-5]，且其花粉活性到目前為止尚未被大眾了解。因此，需要對(duì)這3種植物花粉活性進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行花粉貯藏?；ǚ凼欠N子植物的雄配子體[6]，其活性直接決定植物育種的成??；在生產(chǎn)和雜交育種時(shí)，經(jīng)常會(huì)進(jìn)行遠(yuǎn)距離或不同開(kāi)花期的親本間雜交育種，需要對(duì)花粉粒的活性進(jìn)行保存，而花粉貯藏是花粉活性保存的較好方法[7]。因此，研究花粉粒活性和貯藏條件很有實(shí)踐意義。

本試驗(yàn)對(duì)這3種姜屬植物的花粉活性及貯藏條件進(jìn)行初步探究，旨在為花粉的采集、保存以及雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為光果姜、珊瑚姜和紅球姜盛花期的新鮮花粉，其中光果姜和紅球姜引種于海南，栽培在華南師范大學(xué)生物園，珊瑚姜生長(zhǎng)于廣東省河源市紫金縣的自然種群。每種姜屬植物隨機(jī)采集盛花期剛開(kāi)放的花10朵（每花序只取1朵），剝?nèi)』ㄋ?，用解剖針將花粉收集并混合均勻，置于干燥清潔的離心管中，備用。

1.2 方法

1.2.1 花粉活性檢測(cè)方法篩選

由于前人并未對(duì)3種姜屬植物花粉的活性檢測(cè)方法進(jìn)行探討，所以在測(cè)定花粉活性之前，需要進(jìn)行花粉活性檢測(cè)方法的篩選。本試驗(yàn)將進(jìn)行MTT染色法、聯(lián)苯胺染色法、TTC染色法以及培養(yǎng)基法的篩選，并與柱頭涂抹法進(jìn)行對(duì)比，得到最佳花粉活性檢測(cè)方法。

（1）MTT染色法

參照于安民[8]的方法：用牙簽取適量花粉置于載玻片上，滴入適量MTT染液，攪拌均勻后風(fēng)干，再滴入適量MTT染液，再風(fēng)干后滴入MTT染液，在顯微鏡下觀察。

（2）聯(lián)苯胺染色法

參照左丹丹[9]的方法：用牙簽取適量花粉置于載玻片上，加入1滴聯(lián)苯胺-甲萘酚混合液和1滴0.3%過(guò)氧化氫溶液，靜置3～4 min后，在顯微鏡下觀查。

（3）TTC染色法

參照胡適宜[10]的方法：用牙簽取適量花粉置于載玻片上，滴入適量TTC染液，放置15～20 min后，在顯微鏡下觀察。

以上3種染色法在顯微鏡下觀察，每種方法做6個(gè)裝片的重復(fù)，每個(gè)裝片取3個(gè)視野，每個(gè)視野不少于200粒花粉，與隔火烤至深黃色的滅活花粉進(jìn)行染色對(duì)照，判斷是否成功染色，統(tǒng)計(jì)花粉的染色數(shù)量，得出花粉平均活性。

花粉活性計(jì)算公式為：花粉活性=視野中被染色的花粉數(shù)/視野中花粉總數(shù)×100%

（4）培養(yǎng)基法

將蔗糖培養(yǎng)液設(shè)置0%、3%、5%、8%、10%、12%、15% 7個(gè)濃度梯度，選取對(duì)這3種花粉萌發(fā)影響較大的5個(gè)濃度，將H3BO3培養(yǎng)液設(shè)置0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04% 5個(gè)濃度梯度，將花粉與含有不同蔗糖和H3BO3的培養(yǎng)液充分混合，培養(yǎng)約2 h后統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑視為花粉萌發(fā)，每個(gè)處理做3個(gè)裝片的重復(fù)，每個(gè)裝片取3個(gè)視野，每個(gè)視野不少于100粒花粉。對(duì)比不同配方的花粉萌發(fā)率，得出測(cè)定花粉活性的最佳配方。

以上4種方法得出的花粉活性均要與柱頭涂抹法的結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，得出最佳的花粉活性檢測(cè)方法。

（5）柱頭涂抹法

將即將開(kāi)放的花蕾套袋，待花開(kāi)后進(jìn)行人工異花（異株）授粉處理，授粉2 h后取下花朵（共10朵，每花序只取1朵），將雌蕊置于FAA中固定一段時(shí)間后轉(zhuǎn)入70%酒精中保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)室內(nèi)處理材料，用不同濃度的乙醇溶液（70%、50%、30%、蒸餾水）梯度復(fù)水，NaOH溶液軟化透明，苯胺藍(lán)染色[10]，熒光顯微鏡下觀察、拍照，記錄花粉的萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)柱頭上的花粉數(shù)量及萌發(fā)的花粉數(shù)量，計(jì)算花粉萌發(fā)率。

花粉萌發(fā)率計(jì)算公式為：花粉萌發(fā)率=柱頭上萌發(fā)的花粉數(shù)/柱頭上的花粉數(shù)×100%

1.2.2 常溫下花粉活性變化的檢測(cè)

為了確保雜交工作的順利進(jìn)行，需要對(duì)3種姜屬植物花粉在常溫下的花粉活性變化規(guī)律進(jìn)行了解。在盛花期開(kāi)花時(shí)進(jìn)行花粉采集并立即進(jìn)行花粉活性檢測(cè)，并于每天同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)同一批花粉進(jìn)行花粉活性檢測(cè)，直至花粉失去活性為止?；ǚ刍钚缘臋z測(cè)方法為1.2.1中最佳花粉活性檢測(cè)方法，統(tǒng)計(jì)花粉活性，得出花粉活性變化情況。

1.2.3 花粉貯藏條件的篩選

為了解決不同種之間的花期不遇和異地授粉問(wèn)題，需要對(duì)花粉進(jìn)行貯藏保存。所以，需要對(duì)花粉貯藏條件進(jìn)行篩選，得出最有利于花粉活性保存的條件。本試驗(yàn)將會(huì)對(duì)低溫和干燥對(duì)花粉活性的影響進(jìn)行探究，具體方法如下：將花粉分裝于離心管中，分別進(jìn)行室溫干燥、4℃不干燥、4℃干燥、-20℃不干燥、-20℃干燥、-80℃不干燥、-80℃干燥貯藏。每隔30 d用1.2.1中最佳花粉活性檢測(cè)方法檢測(cè)花粉活力，比較各種貯藏方法的花粉活性，篩選出最佳的貯藏條件。

由于花粉在-20℃和-80℃中貯藏取出后，需要進(jìn)行花粉解凍。所以，需要對(duì)花粉解凍條件進(jìn)行篩選。將花粉分裝于離心管中，置于-20℃和-80℃冰箱內(nèi)30 d后，分別用表1 中的解凍方式進(jìn)行花粉解凍，用1.2.1中最佳花粉活性檢測(cè)方法進(jìn)行花粉活性檢測(cè)，篩選出最佳的-20℃和-80℃貯藏解凍方法。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)采用SPSS. 19.0，統(tǒng)計(jì)分析使用Excel 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活性檢測(cè)方法篩選

各檢測(cè)方法結(jié)果如表2所示。3種姜屬植物新鮮花粉的TTC染色法不能成功讓花粉染上顏色，故該方法不能作為測(cè)定這3種姜屬植物花粉活性的方法。在培養(yǎng)基法中，光果姜花粉的最佳培養(yǎng)基組合為：8%蔗糖+0.03% H3BO3；珊瑚姜花粉的最佳培養(yǎng)基組合為：5%蔗糖+0.04% H3BO3；紅球姜花粉的最佳培養(yǎng)基組合為：5%蔗糖+0.01% H3BO3。而3種花粉的培養(yǎng)基法結(jié)果遠(yuǎn)低于柱頭涂抹法，有顯著性差異，故不能準(zhǔn)確測(cè)定花粉活性。

將這3種花粉的MTT染色法和聯(lián)苯胺染色法結(jié)果與柱頭涂抹法進(jìn)行對(duì)比，光果姜花粉的聯(lián)苯胺染色法與柱頭涂抹法的結(jié)果有顯著性差異，MTT染色法與柱頭涂抹法的結(jié)果較為接近，故光果姜花粉活性的最佳檢測(cè)方法為MTT染色法。珊瑚姜花粉的MTT染色法和聯(lián)苯胺染色法分別與柱頭涂抹法的結(jié)果無(wú)顯著差異，但MTT染色法的標(biāo)準(zhǔn)差較聯(lián)苯胺染色法低，說(shuō)明MTT染色法的結(jié)果較穩(wěn)定，所以珊瑚姜花粉活性的最佳檢測(cè)方法為MTT染色法。紅球姜花粉的MTT染色法和聯(lián)苯胺染色法與柱頭涂抹法的結(jié)果無(wú)顯著差異，但MTT染色法的標(biāo)準(zhǔn)差較低，所以紅球姜花粉活性的最佳檢測(cè)方法為MTT染色法。

綜上所得，MTT染色法為3種姜屬植物花粉活性檢測(cè)最佳方法。

2.2 3種姜屬植物常溫下的花粉活性變化的結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果如圖1顯示，光果姜花粉活性第1天達(dá)（92.13±1.56）%，花粉活性每天逐漸降低，5 d后已完全失去活性；珊瑚姜花粉活性第1天高達(dá)（92.36±1.44）%，2 d后已降至（43.39±5.12）%，3 d后已完全失去活性；紅球姜花粉活性第1天為（86.30±3.28）%，2 d后花粉活性下降7成，降至（11.25±1.13）%，3 d后已完全失去活性。

綜上，3種姜屬植物在剛開(kāi)花時(shí)花粉活性較高，花粉活性隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，光果姜花粉常溫下的放置時(shí)間較其余2種花粉時(shí)間長(zhǎng)。

2.3 低溫條件下不同解凍方法對(duì)3種姜屬花粉活性的影響

由表3可知，光果姜花粉在-20℃貯藏30 d后取出，室溫放置10 min后花粉活性最高，為（48.33±5.33）%。珊瑚姜花粉在直接取出后檢測(cè)，花粉活性為（19.67±4.23）%，其余解凍方法的花粉活性均為0。紅球姜花粉在貯藏30 d后花粉活性為0，沒(méi)有進(jìn)行解凍方法篩選的必要。

根據(jù)表4可知，3種花粉均-80℃貯藏30 d后，直接取出馬上進(jìn)行花粉活性檢測(cè)，測(cè)得的花粉活性最高。光果姜花粉除了-20℃ 1.5 h →4℃ 1.5 h →室溫 0.5 h外，其余方法的結(jié)果與直接取出方式無(wú)顯著差異。珊瑚姜花粉水浴35℃ 5 min后活性與直接取出無(wú)顯著差異，其余方法的結(jié)果均與直接取出有顯著性差異。紅球姜花粉的其余解凍方法比直接取出低約40%，均不利于花粉活性的保存。

2.4 不同貯藏條件對(duì)3種姜屬植物花粉活性的影響

由圖2可以看出，無(wú)論在哪種條件下，3種姜屬花粉活性隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯的下降趨勢(shì)。在室溫干燥、4℃不干燥和4℃干燥貯藏30 d后，3種姜屬花粉已完全失去活性，說(shuō)明這幾種條件不適宜花粉的貯藏。

光果姜貯藏情況如圖2-A所示，在-20℃不干燥與-20℃干燥條件下貯藏，花粉在90 d后完全失去活性。在-80℃不干燥與-80℃干燥條件下貯藏，花粉在120 d后活性降為0。貯藏30 d后，花粉活性的大小順序?yàn)椋?80℃不干燥>-80℃干燥>-20℃干燥>-20℃不干燥，-80℃不干燥與-80℃干燥2種貯藏方式仍能保持較高的活性，4種貯藏方法的結(jié)果均有顯著性差異。貯藏60 d后，花粉活性的大小順序?yàn)椋?-80℃干燥>-80℃不干燥>-20℃干燥>-20℃不干燥，-80℃干燥與-80℃不干燥2種方法的結(jié)果無(wú)顯著性差異，與其余2種方法均有顯著性差異。

由圖2-B可知，在-20℃不干燥、-20℃干燥、-80℃不干燥和-80℃干燥條件下貯藏，珊瑚姜花粉在60 d后完全失去活性。貯藏30 d后，花粉活性已低于50%，花粉活性的大小順序?yàn)椋?80℃干燥>-80℃不干燥>-20℃干燥>-20℃不干燥，-80℃干燥與-80℃不干燥2種方法之間的結(jié)果無(wú)顯著性差異，-20℃干燥與-20℃不干燥之間的結(jié)果無(wú)顯著性差異。

紅球姜貯藏情況結(jié)果顯示（圖2-C）：在-20℃貯藏30 d后，不干燥的花粉活性為0，干燥的花粉活性只有（2.36±0.86）%。所以-20℃的貯藏條件也不適于紅球姜花粉貯藏。在-80℃不干燥和-80℃干燥條件下貯藏，花粉在60 d后完全失去活性。貯藏30 d后，-80℃不干燥的花粉活性大于70%，高于-80℃干燥的花粉活性，2種貯藏方法的結(jié)果有顯著性差異。

綜上，低溫有助于花粉活性的保存，花粉活性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低；光果姜花粉和紅球姜花粉的最佳貯藏方法為-80℃不干燥，珊瑚姜花粉最佳貯藏方法為-80℃干燥。

3 討論

用培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉進(jìn)行離體萌發(fā)的方法，是根據(jù)花粉的萌發(fā)率來(lái)判定花粉的活性情況[11]。這種方法可以完全定量，且與許多植物的結(jié)實(shí)和種子形成具有相關(guān)性，是許多雜交育種中花粉活性測(cè)定的首選方法[9]。但該方法對(duì)培養(yǎng)條件比較敏感，當(dāng)培養(yǎng)條件稍微改變時(shí)，測(cè)定結(jié)果會(huì)相差懸殊[12]。在本試驗(yàn)中3種姜屬植物用培養(yǎng)基法測(cè)定的花粉活性結(jié)果與其余方法相差較大，且遠(yuǎn)低于柱頭涂抹法，說(shuō)明該方法不適用于測(cè)定這3種姜屬植物的花粉活性。蘆娟等[13]在對(duì)油橄欖花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)的時(shí)候也出現(xiàn)相似的結(jié)果。

各種染色法測(cè)定花粉活性，其實(shí)是測(cè)定花粉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或代謝情況[14]，以此判斷花粉的活性，而不是直接表現(xiàn)花粉的萌發(fā)情況。所以只有與花粉在柱頭上的萌發(fā)率進(jìn)行對(duì)比結(jié)果相一致的情況下才可以運(yùn)用。TTC染色法是根據(jù)花粉中呼吸酶的活躍情況來(lái)判定花粉活性的強(qiáng)弱[13]。但在本試驗(yàn)中，該染色法的有活性花粉與無(wú)活性花粉的顏色差別不明顯，所以該方法不適合用于測(cè)定這3種姜屬植物花粉活性。TTC染色法不能使花粉成功著色，同樣在爪葉菊花[15]、辣椒[16]、梨[14]中也出現(xiàn)相類(lèi)似的結(jié)果。聯(lián)苯胺染色法是根據(jù)過(guò)氧化物酶的活性來(lái)判斷花粉的活性[17]，該方法簡(jiǎn)便迅速[11]，但試驗(yàn)中過(guò)氧化氫分解有氣泡產(chǎn)生，會(huì)影響觀察，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果受影響。MTT染色法是根據(jù)花粉中脫氫酶的活性來(lái)判斷花粉的活性[18]。該方法用時(shí)較短，染色結(jié)果清晰容易區(qū)別，且與柱頭涂抹法的結(jié)果最為接近，所以該方法為測(cè)定這3種姜屬植物花粉活性的最佳方法。

3種姜屬植物花粉在常溫下花粉活性會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，這是由于花粉會(huì)進(jìn)行呼吸作用消耗自身貯藏的能量[19]，當(dāng)能量消耗完畢且沒(méi)有補(bǔ)充花粉生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，花粉則會(huì)完全失去其活性。

影響花粉活性最重要的環(huán)境因素是溫度和相對(duì)濕度[20]?？刂七@2個(gè)因素，最大限度地降低花粉的代謝水平，使花粉處于休眠狀態(tài)，這是延長(zhǎng)花粉活性的基本原則[7]。在本試驗(yàn)中，3種姜屬植物的花粉在不同溫度條件下進(jìn)行貯藏，貯藏溫度越低，花粉活性保存得越好，他人的研究也表明，溫度與花粉貯藏壽命呈負(fù)相關(guān)性，溫度越低，花粉貯藏壽命越長(zhǎng)[21]。大概是因?yàn)闇囟壬邥?huì)增強(qiáng)花粉內(nèi)部的呼吸強(qiáng)度，導(dǎo)致花粉的營(yíng)養(yǎng)消耗[22]。光果姜和紅球姜花粉在-80℃條件下干燥貯藏30 d的活性比不干燥的低，說(shuō)明這2種花粉在貯藏過(guò)程中不能過(guò)于干燥。在一定范圍內(nèi)，相對(duì)濕度與花粉貯藏壽命也呈負(fù)相關(guān)性，可使花粉代謝受到抑制而使花粉貯藏壽命延長(zhǎng)[23]，但極干燥的條件也不利于花粉保存。有研究表明，很多物種花粉在貯藏時(shí)含水量不能低于40%[24]。但珊瑚姜花粉在-80℃條件在干燥貯藏30 d的活性較高，說(shuō)明不同種之間對(duì)干燥貯藏條件的要求有差異。

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