王丹 藍(lán)惠萍 張影波 于福來 陳曉鷺 黃梅 王凱 龐玉新

摘 要 以兩年生艾納香苗為實(shí)驗(yàn)材料，用七水合硫酸鎂提供鎂素，研究鎂對艾納香藥材生物量、3種抗氧化酶活性、總黃酮和l-龍腦百分含量和單株產(chǎn)量。結(jié)果表明，鎂顯著增加了艾納香生物量。與其他處理組相比，5、10和80 mg/mL鎂處理的SOD和CAT活性較高，而POD活性較低。不同濃度的鎂處理顯著提高了艾納香中總黃酮百分含量、總黃酮單株產(chǎn)量以及l(fā)-龍腦單株產(chǎn)量，其中5、10和80 mg/mL鎂處理組最顯著。而10 mg/mL鎂處理下的l-龍腦百分含量最高。因此，綜合以上結(jié)果，10 mg/mL鎂處理為兩年生艾納香施用的最佳濃度，能顯著提高藥材生物量和藥材質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 鎂 ；艾納香 ；生物量 ；總黃酮 ；l-龍腦 ；抗氧化酶

中圖分類號 S567，71 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.07.011

Abstract The seedlings of Blumea balsamifera （L.） DC at the age of 2 years old were treated with different concentrations of magnesium （Mg） to determine their biomass， 3 antioxidant enzyme activities and the percentage composition and yield per plant of total flavonoids and l-borneol. The results showed that the different concentrations of Mg significantly increased the biomass. The activities of SOD and CAT in the treatments with Mg at 5， 10 and 80 mg/ml were higher， while the activity of POD was lower. The different concentrations of Mg significantly increased the percentage composition and yield per plant of total flavonoids， and the 80 mg/mL Mg treatment had the highest percentage composition and yield per plant of total flavonoids. The percentage composition and yield per plant of l-borneol were the highest in the 10 mg/ml Mg treatment. Therefore， the best concentration of Mg was 10 mg/ml for dressing the 2 years old seedlings of B. balsamifera （L.） DC， which increased significantly the biomass and the quality of B. balsamifera （L.） DC.

Keywords magnesium （Mg） ； Blumea balsamifera ； biomass； total flavonoids ； L-bornoel ； antioxidant enzyme

艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC.]是中國藥典（2015版一部）規(guī)定的天然艾片（l-龍腦）的唯一來源。艾片是艾納香的新鮮葉經(jīng)提取加工制成的結(jié)晶，龍腦計(jì)算，不得少于85.0%，具有開竅醒神，清熱止痛功效，常用于熱病神昏、痙厥，中風(fēng)痰厥，氣郁暴厥，中惡昏迷，目赤，口瘡，咽喉腫痛，耳道流膿等[1]。近年來，由于人們對艾片需求的不斷增加，導(dǎo)致野生艾納香資源已不能滿足生產(chǎn)的需要。因此，人工栽培艾納香成為解決這一問題的必然途徑[2]。何元農(nóng)等[3-4]研究發(fā)現(xiàn)，3種農(nóng)家肥（圈肥、油枯和柴灰）、3種一元化肥（尿素、過磷酸鈣和氯化鉀）以及復(fù)合肥可以顯著提高艾納香經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和生物產(chǎn)量，氮肥可以提高艾納香的產(chǎn)量和有效成分含量，但是要控制用量。王丹等[5-10]研究發(fā)現(xiàn)，在冬季艾納香生長的遲緩期，施用鈣、鎂、錳元素以及萘乙酸、赤霉素和DA-6等可以顯著促進(jìn)艾納香生長，提高葉、莖和根的生物量，顯著提高有效成分總黃酮和l-龍腦的單株產(chǎn)量，但是對總黃酮和l-龍腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高作用不顯著。藍(lán)惠萍等[11]發(fā)現(xiàn)，氮、磷、鉀元素配施可以顯著提高艾納香產(chǎn)量和l-龍腦相對含量的積累，對產(chǎn)量影響作用依次為氮>鉀>磷。

鎂作為繼氮、磷、鉀之后植物第四大必需營養(yǎng)元素，是植物生長發(fā)育的重要營養(yǎng)元素，其供給水平直接影響著植物的生長發(fā)育和生物量積累[7]。鎂是植物細(xì)胞中重要的二價(jià)陽離子，是葉綠素的中心離子，還是很多酶的活化劑，參與植物能量代謝，對促進(jìn)植物生物量積累等具有重要作用[12]。通過前期研究發(fā)現(xiàn)，1.5、15和150 mg/mL 鎂對一年生長期的艾納香株高、地徑、葉長、葉寬等生長指標(biāo)以及藥材產(chǎn)量有顯著的促進(jìn)作用，對l-龍腦百分含量和單株產(chǎn)量的增加有促進(jìn)作用。在此基礎(chǔ)，通過細(xì)化鎂素濃度和增大樣本量，進(jìn)一步研究鎂對兩年生艾納香生長期產(chǎn)量、抗氧化酶以及有效成分l-龍腦和總黃酮百分含量和單株產(chǎn)量的影響。以期更加了解鎂對不同生長年限艾納香產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，確定最適宜的施肥時(shí)期、施肥量，為后期指導(dǎo)艾納香施肥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇長勢基本一致的兩年生艾納香苗為實(shí)驗(yàn)材料，該材料經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所研究員龐玉新鑒定為Blumea balsamifera （L.） DC.，以MgSO4·7H2O提供鎂元素，共設(shè)置5個(gè)鎂處理濃度：5、10、20、40、80 mg/mL，另設(shè)不施肥和水，不進(jìn)行任何處理的空白對照組CK。分別于6月5日和7月5日進(jìn)行2次施肥，于12月15日進(jìn)行取樣，重復(fù)4次。

1.2 方法

1.2.1 生物量的測定

使用電子秤測定艾納香藥材葉片生物量。

1.2.2 3種抗氧化酶活性測定

選取每個(gè)處理組下的每棵艾納香植株的成熟葉片，去除葉脈，在固定的區(qū)域剪成長1.0 cm，寬0.2 cm左右的細(xì)絲，混和均勻，精密稱定0.5 g，加入4.5 mL的PBS溶液（0.1 mol/L，pH=7.4），按質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶9進(jìn)行勻漿，6 000 r/min離心10 min，得到10%的組織勻漿，置于-20℃下，備用。分別按照超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性測定試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行測定。

1.2.3 總黃酮百分含量和單株產(chǎn)量測定

精密稱取樣品粉末（過20目篩）適量，置具塞錐形瓶中，加75%乙醇溶液25 mL，稱重。在40 kHz、功率為400 W的超聲條件下提取40 min，靜置冷卻，稱重，用75%乙醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，過濾，取1 mL續(xù)濾液置于25 mL容量瓶中，加75%乙醇約至10 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置5 min，再加10% Al（NO3）3 溶液1 mL，搖勻，放置5 min后，加4% NaOH 溶液10 mL，最后以75%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)的試劑溶液為空白對照，使用紫外分光光度儀在509 nm處測定吸光度A，計(jì)算其百分含量。再將總黃酮百分含量與艾納香單株生物量相乘，獲得總黃酮單株產(chǎn)量[7]。

1.2.4 l-龍腦含量測定

依據(jù)《中國藥典》（2015版）的氣相色譜法（GC）測定艾納香中l(wèi)-龍腦百分含量[1]。精密稱取艾納香新鮮葉3.000 g置于50 mL具塞試管中，加入乙酸乙酯溶液24 mL，封口，超聲處理40 min，靜置并抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至25 mL，搖勻，移取2.0 mL于10 mL容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)液水楊酸甲酯1.0 mL，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻。采用HP-5石英毛細(xì)管色譜柱（0.32 mm×30 m，0.25 μm），以50℃為起始溫度，保持2 min，先以5℃/min升溫至100℃，然后以20℃/min升溫至200℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度220℃；檢測器溫度240℃；進(jìn)樣量為0.6 μL，不分流。再將l-龍腦百分含量與艾納香單株生物量相乘，獲得l-龍腦單株產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎂對兩年生艾納香葉片生物量的影響

由圖1可知，不同濃度的鎂處理對艾納香葉片生物量影響結(jié)果不同。與CK組相比，5個(gè)濃度鎂處理組艾納香葉片生物量均顯著增加，分別增加了35.29%，46.28%，26.67%，33.33%和38.04%。5個(gè)鎂處理組間葉片生物量差異不顯著。

2.2 鎂對兩年生艾納香SOD活性的影響

由圖2可知，不同濃度的鎂處理對艾納香SOD活性影響結(jié)果不同。隨著鎂濃度濃度的增加，SOD活性呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢。CK組和40 mg/mL 鎂處理組的SOD活性最低，分別為34.09和33.30 U/g FW/min，顯著低于5、10和80 mg/mL 鎂處理組，分別降低32.28%、28.58%、26.66%和33.85%、30.23%、28.36%。

2.3 鎂對兩年生艾納香POD活性的影響

由圖3可知，不同濃度的鎂處理對艾納香POD活性影響結(jié)果不同。5、10和80 mg/mL 鎂處理組POD活性最低，明顯低于40 mg/mL 鎂處理組，分別降低了18.67%、17.27%和16.18%。

2.4 鎂對兩年生艾納香CAT活性的影響

由圖4可知，不同濃度的鎂處理對艾納香CAT活性影響結(jié)果不同。5和80 mg/mL鎂處理組CAT活性最高，分別為16.57和15.32 U/gFW/min，顯著高于CK組45.35%和34.39%，與其他處理間差異不顯著。

2.5 鎂對兩年生艾納香總黃酮百分含量的影響

由圖5可知，不同濃度的鎂處理對艾納香中總黃酮百分含量增加均有不同程度促進(jìn)作用，顯著高于對照處理組。其中，80 mg/mL鎂處理組的總黃酮百分含量最高，為1.62%，分別是CK組以及5～40 mg/mL 鎂處理組的7.36、2.22、2.10、3.45和2.61倍。其次是5和10 mg/mL 鎂處理組，總黃酮百分含量分別為0.73%和0.77%，顯著高于CK組和20 mg/mL 鎂處理組。

2.6 鎂對兩年生艾納香總黃酮單株產(chǎn)量的影響

由圖6可知，不同濃度的鎂處理對艾納香中總黃酮單株產(chǎn)量增加均有不同程度促進(jìn)作用，顯著高于CK組。80 mg/mL 鎂處理組最高為5.62 kg，顯著高于CK和其他處理組，分別是CK組以及5～40 mg/mL 鎂處理組的10.37、2.26、1.97、3.75和2.69倍。其次，是10 mg/mL 鎂處理組，為2.86 kg，顯著高于其他處理組。CK組總黃酮單株產(chǎn)量最低，僅為0.54 kg。

2.7 鎂對兩年生艾納香l-龍腦百分含量的影響

由圖7可知，不同濃度的鎂處理對艾納香中l(wèi)-龍腦百分含量影響不同。10 mg/mL 鎂處理組的l-龍腦百分含量最高，顯著高于CK、5和40 mg/mL 鎂處理組，分別增加了34.09%、28.26%和43.90%，與20和80 mg/mL 鎂處理組差異不顯著。

2.8 鎂對兩年生艾納香l-龍腦單株產(chǎn)量的影響

由圖8可知，不同濃度的鎂處理對艾納香中l(wèi)-龍腦單株產(chǎn)量增加均有不同程度促進(jìn)作用。其中，10 mg/mL 鎂處理組的l-龍腦單株產(chǎn)量最高，為2.21 kg，顯著高于CK和其他處理組，分別是CK組以及5～80 mg/mL 鎂處理組的1.99、1.40、1.29、1.60和1.26倍。其次為80 mg/mL 鎂處理組，顯著高于CK組和40 mg/mL 鎂處理組，與5和20 mg/mL 鎂處理組間差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

鎂是植物生長和發(fā)育所必需的中量營養(yǎng)元素，對植物生長發(fā)育起至關(guān)重要的作用[13]。鎂是合成植物葉綠素的必需元素，有利于植物光合作用，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長和生物量積累[14]。這與本研究的結(jié)果一致，不同濃度的鎂顯著促進(jìn)艾納香生物量的積累，提高藥材產(chǎn)量。

植物體自身的抗氧化系統(tǒng)可抵御外界不良環(huán)境的影響，當(dāng)植物受到營養(yǎng)元素缺乏、重金屬毒害等逆境脅迫時(shí)，活性氧產(chǎn)生加快，保護(hù)酶防御系統(tǒng)遭到破壞，活性氧清除能力下降[15]。SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的3種關(guān)鍵酶，是植物體內(nèi)活性氧酶促清除系統(tǒng)中的一種重要的防御酶，可催化超氧陰離子快速歧化成H2O2和O2-，在減輕脂質(zhì)過氧化作用和膜傷害方面起重要作用，在維持活性氧產(chǎn)生與清除過程中起到重要作用[16-17]。而Mg+具有膜穩(wěn)定性，參與離子運(yùn)輸調(diào)控，調(diào)節(jié)抗氧化酶活性等多種生理功能[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，施加不同濃度的鎂可以提高艾納香的SOD和CAT活性，其中5、10和80 mg/mL 鎂處理組SOD活性最高，5和80 mg/mL 鎂處理組CAT活性最高。這與鎂在花生[16]、大豆[17]、厚皮西瓜[18]上的研究結(jié)果基本一致。POD活性與二者結(jié)果相反，5、10和80 mg/mL 鎂處理組POD活性最低，顯著低于CK組和40 mg/mL 鎂處理組。這說明適當(dāng)濃度的鎂可以提高艾納香SOD和CAT活性，降低POD活性，維持植物正常生理。本試驗(yàn)結(jié)果和前人的研究結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的鎂可以調(diào)節(jié)植物抗氧化酶系統(tǒng)，但是參與作用的抗氧化酶種類和活性則因物種不同而有所差異[19]。

鎂不僅對植物生長、生理等初生代謝有影響，對植物次生代謝也有影響。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的鎂均可以提高艾納香總黃酮百分含量和單株產(chǎn)量。這可能由于鎂是植物體內(nèi)多種酶的活化劑，幾乎所有的磷酸化酶、磷酸激酶、二磷酸核酮糖羧化酶都需要鎂的激活或者活化，并且鎂還是一些植物酶的重要組成部分，影響植物初生和次生代謝過程[12]。與總黃酮影響結(jié)果不同，只有10 mg/mL 鎂處理對l-龍腦百分含量和單株產(chǎn)量積累的促進(jìn)作用最顯著，其他處理組對l-龍腦百分含量影響不顯著，對l-龍腦單株產(chǎn)量的提高有不同程度的促進(jìn)作用。這可能由于鎂是構(gòu)成l-龍腦生物合成關(guān)鍵酶的必需元素。單萜合酶是催化l-龍腦合成的第一個(gè)酶，以單體或同型二聚體的形式催化反應(yīng)，每個(gè)單體的催化都需要結(jié)合二價(jià)金屬離子Mg2+，并通過氫鍵絡(luò)合H2O-Mg2+復(fù)合物和自由H2O以形成基本空間結(jié)構(gòu)。后續(xù)的催化狀態(tài)需要繼續(xù)結(jié)合Mg2+，穩(wěn)定C端空間結(jié)構(gòu)[20-23]。這可能是由于鎂通過影響單萜合酶的催化活性，來影響l-龍腦的形成和積累。

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