姜秀云，周步丹，董 陽，包艷紅，陳敬蕊，劉 磊，王春芳，徐博文，馬紅霞

牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的以牛、鹿等動物為主的動物和人慢性細(xì)菌性疫病，世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)將其列為B類傳染病。目前，牛結(jié)核菌素(Purified Protein Derivative，PPD)變態(tài)反應(yīng)是OIE指定的唯一檢測牛結(jié)核病的方法[1]，但是該方法特異性差，并且對陽性牛行隔離或捕殺所帶來經(jīng)濟(jì)損失在許多國家無力承擔(dān)。另因卡介苗(Bacillus of Calmette and Guerin，BCG)無法用于牛結(jié)核病的預(yù)防。因此，研發(fā)牛結(jié)核病的新型診斷試劑和預(yù)防疫苗。

MPB51和MPB70皆是結(jié)核分枝桿菌的主要分泌蛋白，且只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，兩者在臨床檢測中具有良好的敏感性和特異性[2-3]。MPB51中存在CD4+T和CD8+T 細(xì)胞抗原表位，可誘導(dǎo)免疫小鼠脾細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ[4]。MPB70中存在多個產(chǎn)生IFN-γ 的Th1型細(xì)胞抗原表位，mpb70重組質(zhì)粒DNA能激發(fā)免疫動物產(chǎn)生Th1型應(yīng)答反應(yīng)，但MPB70在不同BCG菌株中表達(dá)水平較低或缺失[5]，影響了BCG的臨床效果?？梢姡琈PB51和MPB70均是結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)性抗原，可作為新型診斷抗原和疫苗的候選蛋白。據(jù)報道，抗體檢測能提高牛結(jié)核病診斷的敏感性[6-8]，融合蛋白或多重抗原可以提高牛結(jié)核病檢測的敏感性和特異性[9-11]，并具有良好的免疫原性[12-14]。為開發(fā)牛結(jié)核病敏感、特異的診斷抗原和高效重組疫苗，利用重疊拼接 (Splicing by Overlapping Extension，SOE) PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)牛分枝桿菌mpb51和mpb70基因相融合，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并明確其抗原性。為進(jìn)一步研究MPB51-MPB70作為新型檢測抗原及疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒與載體EscherichiacoliJM109、E.coliDH5ɑ、E.coliBL21(DE3)、pET28a(+)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。pGEM-T-51[15]、pGEM-T-70[16]由筆者構(gòu)建與保存。T-Vector pMD19購于TaKaRa公司。

1.2主要試劑 Pyrobest DNA Polymerase、LATaqDNA聚合酶、dNTPs、BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶及DNA Markers、DNA回收純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Spanish公司產(chǎn)品；溶菌酶、牛血清白蛋白(BSA)為Bebco公司產(chǎn)品；氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、RNase A為Sigma公司產(chǎn)品；酵母浸出粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品；牛結(jié)核血清自剖檢結(jié)核病變牛血液分離；HRP標(biāo)記兔抗牛IgG二抗為北京鼎國生物工程有限公司產(chǎn)品。Ni-NTA Agarose為克勞寧(北京)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3引物的設(shè)計與合成 根據(jù)mpb51、mpb70的基因序列設(shè)計PCR引物，序列如下：P151: 5′ TAGGATCCATGGCCCCATACGAGAA 3′，P251: 5′CGATCCGCCACCGCCAGAGCCTCCACCTCCTGAACCGCCTCCACCGCGGATCGCACC 3′,P170: 5′GGTGGAGGCGGTTCAGGAGGTGGAGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGGCGATCTGGTGGGC3′，P270: 5′GCGGAATTCTTACGCCGGAGGCATTAG 3′, P151、P270的斜體部分分別是BamHⅠ和EcoRⅠ內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。上述引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。

1.4目的基因的擴(kuò)增及產(chǎn)物的純化 以pGEM-T-51、pGEM-T-70為模板，以P151和P251、P170和P270為引物，利用Pyrobest DNA Polymerase分別對mpb51與mpb70基因進(jìn)行擴(kuò)增。以mpb51和mpb70基因的PCR純化產(chǎn)物為模板，以P151和P270為引物，以LATaqDNA 聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 90 s，35個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠，并利用DNA凝膠回收純化試劑盒純化。

1.5mpb51-mpb70融合基因的克隆和序列測定 用 Solution I 對純化的mpb51-mpb70 PCR產(chǎn)物和T-Vector pMD19進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-51-70，轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)1.5 h，涂布于含Amp(100 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌接種于5 mL含Amp 的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min過夜培養(yǎng)。利用小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過BamHⅠ、EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。選取陽性質(zhì)粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.6原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 對重組質(zhì)粒pMD-51-70和pET28a(+)均以BamHⅠ、EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，純化的產(chǎn)物利用T4 DNA Ligase連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-51-70，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)中，涂布于含Kan(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取轉(zhuǎn)化菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.7融合基因的表達(dá)與分析 將重組表達(dá)菌株接種于5 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。取2 mL菌液接種至50 mL含Kan 的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至OD600nm≈0.6-0.7，用終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)7 h，期間每隔1 h留取少許菌液。將留取的菌液OD600nm調(diào)至0.6，取菌液1.2 mL，離心，于沉淀中加蒸餾水100 μL。樣品處理后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.8重組蛋白的純化 表達(dá)MPB51[15]、MPB70[16]及MPB51-MPB70的重組菌株經(jīng)IPTG 于25 ℃下誘導(dǎo)，收集菌體，低溫超聲破碎后，按產(chǎn)品說明書進(jìn)行Ni-NTA純化。純化的蛋白于-20 ℃保存。

1.9融合蛋白的鑒定 純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，通過半干式碳板轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，1%BSA封閉后，以牛結(jié)核血清為一抗，HRP標(biāo)記兔抗牛IgG抗體為二抗，聯(lián)苯胺為底物，進(jìn)行Western blotting鑒定。

1.10融合蛋白抗原性鑒定與比較 以不同濃度的MPB51-MPB70為抗原，不同稀釋倍數(shù)的牛結(jié)核陰、陽性血清為一抗，1∶2 000 HRP標(biāo)記兔抗牛IgG為二抗，鄰甲苯胺為底物，通過棋盤法確定間接ELISA最適抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。以陽性血清OD492nm>1，P/N比值最大者的抗原濃度和血清稀釋倍數(shù)作為MPB51-MPB70的最適包被濃度和最適血清稀釋倍數(shù)。以MPB51-MPB70最適包被濃度和血清最適稀釋倍數(shù)對10頭份牛結(jié)核陰、陽性血清進(jìn)行間接ELISA檢測，并與MPB51(包被濃度為3/5的MPB51-MPB70)、MPB70(包被濃度為2/5的MPB51-MPB70)為抗原的間接ELISA比較抗原性。

2 結(jié) 果

2.1目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物mpb51、mpb70及mpb51-mpb70擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示。從圖中可見，擴(kuò)增的mpb51、mpb70和mpb51-mpb70 DNA片段分別是849 bp、555 bp、1359 bp，均和預(yù)期DNA片段大小相一致。

2.2mpb51-mpb70 融合基因的克隆與鑒定 mpb51-mpb70 融合基因PCR產(chǎn)物與pMD19 連接，獲得了重組質(zhì)粒pMD-51-70，經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，電泳可見2 692 bp的pMD19線性片段和1 359 bp的插入片段(圖2)。序列測定表明，mpb51-mpb70 融合基因的大小為1359 bp，與目的片段大小一致，且沒有序列插入、缺失及改變的現(xiàn)象，成功地獲得了牛分枝桿菌mpb51-mpb70融合基因。

1-3: 分別為mpb51、mpb70和mpb51-mpb70基因的 PCR產(chǎn)物；M: DNA markerLane M, DNA marker /DL2000; Lanes 1-3, PCR products of mpb51, mpb70 and mpb51-mpb70 genes, respectively圖1 mpb51、mpb70和mpb51-mpb70的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of mpb51, mpb70 and mpb51-mpb70 genes

1-2: pMD-51-70 質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物; M1: DNA marker λDNA/Hind III; M2: DNA marker/DL2000Lanes 1-2, products of pMD-51-70 digested by enzyme; Lane M1, DNA marker λDNA/Hind III; Lane M2,DNA marker/DL2000圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Restriction analysis map of pMD-51-70

2.3原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 在T4 DNA Ligase 的作用下，mpb51-mpb70和pET28a(+)連接，經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，電泳后見到5367 bp pET28a(+)載體片段和1 359 bp 插入片段(圖3)。成功地構(gòu)建了mpb1-mpb70重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-51-70。

2.4融合蛋白的表達(dá)分析 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，E.coliBL21(DE3)中pET-51-70在各時間表達(dá)蛋白的SDS-PAGE結(jié)果如圖4所示。從圖可見，融合基因mpb51-mpb70 獲得了表達(dá)，其表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間的延長而增加，誘導(dǎo)3 h達(dá)到高峰，MPB51-MPB70融合蛋白的相對分子量約為45 ku。而pET28a(+)E.coliBL21(DE3)中則未見該融合蛋白表達(dá)。

1: pET-51-70; 2: pET-51-70 的酶切產(chǎn)物; M1：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn); M: DNA MarkerLane 1, pET-51-70; Lane 2, Products of pET-51-70 digested by enzyme; Lane M, λ DNA digested with Hind Ⅲ圖3 原核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Restriction analysis map of pET-51-70

1:pET-28a(+) 在E.coli BL21誘導(dǎo)7h; 2-9:分別是pET-51-70在E.coli BL21誘導(dǎo)0-7 h; M:蛋白質(zhì)MarkerLane1, pET-28a(+) expression result in E.coli BL21 with IPTG induced 7h, as control; Lanes 2-9, expression results in E.coli BL21 with IPTG induced 0-7h, respectively; Lane M, low molecular weight protein marker圖4 mpb51-mpb70在E.coli BL21中的表達(dá)Fig.4 The mpb51-mpb70 recombinant expression plasmid expressed by prokaryotic expression vector in E.coli BL21

2.5目的蛋白的純化 MPB51-MPB70、MPB70、MPB51經(jīng)Ni-NTA純化后的SDS-PAGE結(jié)果如圖5所示。圖中可見純度較高的目的蛋白帶。

2.6融合蛋白的鑒定 純化的MPB51-MPB70融合蛋白Western blotting 結(jié)果如圖6所示。從圖中可見45 ku處存在一條蛋白印跡帶，證明該融合蛋白MPB51-MPB70能夠與牛結(jié)核血清反應(yīng)，且具有較好的反應(yīng)性。

1-2: MPB51-MPB70;3:MPB70;4-5:MPB51;M:蛋白質(zhì)markerLanes1-2, MPB51-MPB70; Lane 3, MPB70; Lanes 4-5, MPB51; Lane M, low molecular weight protein marker圖5 原核表達(dá)蛋白的純化Fig.5 Purification of prokaryotic recombinant expression proteins

1-2: MPB51-MPB70; M: 蛋白質(zhì)MarkerLanes 1-2, MPB51-MPB70 fusion protein; Lane M, low molecular weight protein marker圖6 MPB51-MPB70的Western blotting鑒定Fig.6 Western blotting of the MPB51-MPB70 fusion protein

2.7MPB51-MPB70 的抗原性 通過棋盤法確定MPB51-MPB70的最適包被濃度為50 ng/mL，血清最適稀釋倍數(shù)為400倍。以MPB51-MPB70(50 ng/mL)、MPB51(30 ng/mL)、MPB70(20 ng/mL)對牛結(jié)核陰、陽性血清的間接ELISA檢測結(jié)果如圖7所示。從圖中可見，同一陽性血清的反應(yīng)性(OD492nm)MPB51-MPB70比MPB51、MPB70均高，而3種重組蛋白對陰性血清檢測結(jié)果均較低(OD492nm<0.12)，表明MPB51-MPB70具有良好的抗原性。

3 討 論

長期以來，在動物結(jié)核病的防制方面，盡管采取檢疫、隔離與淘汰等一系列措施，也未能從根本上控制該病。其原因在于沒有切實(shí)可行的疫苗，因此，開發(fā)新型、高效、安全的疫苗一直是動物結(jié)核病研究的重點(diǎn)所在。另外，結(jié)核病的診斷抗原敏感性或特異性尚待提高，因此，研發(fā)敏感、特異的診斷抗原也一直倍受注目。

圖7 重組蛋白的間接ELISA檢測Fig.7 Indirect ELISA detection of bovine serum by recombinant protein

在結(jié)核病的血清學(xué)診斷中，Bethunaickan等[17]用MPT51檢測了痰液涂片和培養(yǎng)陽性的結(jié)核病患者血清中特異性IgG和IgA，結(jié)果顯示IgG的敏感性和特異性分別為57%、98%，IgG+IgA的敏感性和特異性分別為71%、95%。Cho等[18]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，牛分枝桿菌MPB70、MPB83、MtbE等20 kD高抗原性蛋白是適于結(jié)核病牛進(jìn)行ELISA檢測的抗原。Cho等[3]報道，與PPD比較，牛分枝桿菌MPB70對感染結(jié)核的牛血清有著更高的敏感性和特異性，分別是84%和100%。Waters等[6]采用IDEXXM.bovisELISA(MPB83/MPB70融合抗原)檢測了自然感染結(jié)核的牛血清，其敏感性和特異性分別是63%和98%，并可作為感染牛皮試陰性的補(bǔ)充試驗(yàn)。Souza等[9]比較了CFP-10、ESAT-6、MPB83、Mb0143、PE5、PE13、TB10.4、TB15.3及ESAT-6/MPB70/MPB83融合蛋白檢測皮試陽性牛的血清，結(jié)果顯示ESAT-6/MPB70/MPB83融合蛋白的敏感性是83.2%，高于每1種單一蛋白。

Wang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MPT51能誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生高水平IFN-γ，可作為結(jié)核病疫苗和感染分析的目標(biāo)蛋白。Hashimoto等[20]構(gòu)建了MPT51重組慢病毒，誘導(dǎo)小鼠肺部產(chǎn)生特異性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。Uchijima等[21]報道了編碼MPT51和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)融合蛋白的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。de Sousa等[12]評估了結(jié)核桿菌重組ag85c-mpt51-hspx(CMX)融合蛋白的抗原性，結(jié)果顯示，免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的抗CMX特異性IgG1和IgG2a，脾細(xì)胞中特異性TCD4 IFN-γ+和TNF-α+的數(shù)量增加，活動性肺結(jié)核患者血清中抗CMX IgG和IgM明顯高于健康的人 (P<0.0001)。Junqueira-Kipnis等[22]構(gòu)建了結(jié)核桿菌Ag85c、MPT51、HspX (CMX)重組恥垢分枝桿菌，小鼠免疫試驗(yàn)顯示，CMX重組疫苗可誘導(dǎo)特異性IgG1或IgG2a反應(yīng)，肺和脾中CMX特異性CD4+T和CD8+T細(xì)胞顯著增加(P<0.05)，并產(chǎn)生IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-2。

綜上研究結(jié)果表明，MPB51和MPB70在結(jié)核病診斷和疫苗研究中具有較好的應(yīng)用前景。因此，為提高單一蛋白的抗原性，采用 SOE PCR 將牛分枝桿菌保護(hù)性抗原基因mpb51和mpb70以45個核苷酸Link連接，使兩個蛋白之間存在15個氨基酸(Gly4Ser)3的柔性肽段，以保證各自蛋白的空間結(jié)構(gòu)及免疫活性。本研究成功地獲得了mpb51-mpb70 融合基因，序列分析證實(shí)，堿基序列一致，編碼區(qū)域正確。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了mpb51-mpb70 融合基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌中表達(dá)了融合蛋白。純化的MPB51-MPB70經(jīng)間接ELISA檢測顯示出比單一蛋白更高的抗原反應(yīng)性。為進(jìn)一步研究牛結(jié)核病的診斷試劑、新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。