張 芳,張新宇

(上海大學環(huán)境與化學工程學院環(huán)境污染與健康研究所,上海200444)

1-氯-3-丁烯-2-醇(1-chloro-2-hydroxy-3-butene,CHB)是1,3-丁二烯的代謝產物[1].1,3-丁二烯是一種主要來源于汽車尾氣和生物質不完全燃燒(如香煙煙霧)的環(huán)境污染物,在2008年被國際癌研究局(International Agency for Research on Cancer,IARC)分級為人類致癌物(Group 1)[2].已有多項研究結果顯示,1,3-丁二烯屬于致癌風險最高的環(huán)境污染物之一,其致癌風險在某些情形下甚至超過了苯[3-5].因此,對1,3-丁二烯毒性機理進行研究具有重要的現(xiàn)實意義.

硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的無色氣體,劇毒,也是一種環(huán)境污染物.H2S在低百萬分濃度(10×10?6～100×10?6)時會對呼吸道及眼睛產生刺激作用,在高百萬分濃度(530×10?6～1 000×10?6)時會對中樞神經系統(tǒng)產生強烈刺激作用,引起呼吸停止甚至死亡[6].同時,H2S是繼NO和CO后被識別出的第3種氣體第二信使分子,具有極其廣泛的生理功能,幾乎涉及到了哺乳動物體內所有的生理過程,并對心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等的生理功能具有重要影響.反常的H2S代謝與很多疾病密切相關,如哮喘、動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓、神經退化性疾病以及癌癥等[6].對H2S生理功能和相關分子機理的研究已成為生物學領域的主要熱點之一.

作為一種第二信使分子,H2S在細胞內存在內源性產生途徑,主要是以半胱氨酸為底物,通過酶的作用而形成.目前已知的能產生H2S的3種酶是胱硫醚-β-合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)和 3-巰基丙酮酸鹽硫轉硫酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MST).由于H2S涉及到多種生理功能,因此抑制H2S的內源性產生可能會誘發(fā)各種疾病.例如,飼以炔丙基甘氨酸(一種CSE抑制劑)的大鼠血壓上升[7],CSE基因敲除的小鼠表現(xiàn)出了明顯的高血壓[8].顯然,如果外源性化合物能夠抑制體內H2S的產生,則很可能同樣誘發(fā)高血壓或者其他疾病.因此,研究外源性化合物對體內H2S產生的影響對于理解這些化合物生理效應的分子機理非常有意義.

本工作研究了CHB對人胚肝L02細胞內源性H2S濃度的影響.用不同濃度的CHB孵育L02細胞1 h,收集并進行超聲裂解后檢測細胞裂解液中H2S的濃度.為了驗證結果的可靠性,使用O-(羧甲基)羥胺(O-(carboxymethyl)hydroxyl-amine,CMHA)孵育細胞進行平行實驗.CMHA是一種CSE的強抑制劑,也可抑制CBS[9].

有多種方法可檢測生物樣品中的H2S濃度,如亞甲基藍比色法、硫離子電極法、3-溴甲基-2,5,6-三甲基-1H,7H-吡咯并[1,2-a]吡咯-1,7-二酮(3-bromomethyl-2,5,6-trimethyl-1H,7H-pyrazolo[1,2-a]pyrazole-1,7-dione,MBB)法、熒光染料法、氣相色譜法和安培傳感器法等[10].本工作選擇了MBB法,其原理是H2S用熒光標記試劑MBB進行衍生化反應, 形成產物 3,3’-(硫雙亞甲基)雙(2,5,6-三甲基-1H,7H-吡咯并[1,2-a]吡咯-1,7-二酮)(3,3’-[thiobis(methylene)]bis[2,5,6-trimethyl-1H,7H-pyrazolo[1,2-a]pyrazole-1,7-dione],SDB,見圖1).MBB自身不會發(fā)出熒光,而產物SDB會發(fā)出很強的熒光.反應后的樣品在高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀上進行分離,用熒光檢測器進行定量,從而獲得樣品中的H2S濃度[11].

圖1 H2S用MBB進行衍生化反應Fig.1 Derivatization of H2S with MBB

1 材料與儀器

1.1 主要材料與試劑

MBB,CMHA,硫化鈉(Na2S·9H2O),5-磺基水楊酸(sulfosalicylic acid,SSA)購于Sigma-Aldrich(USA).三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris,BR試劑)、二乙三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid,DTPA)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)以及其他未一一列出的化合物購于國藥集團化學試劑公司(上海)(如未特別指明,試劑純度均為分析純).牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)購于上海前塵生物科技有限公司(上海). 改良的 Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)和胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)購自Invitrogen(USA).青霉素和鏈霉素購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司(北京).人胚肝L02細胞購自中國科學院細胞庫(上海).CHB按照文獻[12]的方法合成.

1.2 儀器設備

本工作所使用的主要儀器設備如下:Waters Alliance 2695 HPLC系統(tǒng),配置Waters 2475多通道熒光檢測器(Milford,MA,USA);Agilent ZORBAX 80?A StableBond SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm)(Palo Alto,CA,USA);Bio-Rad iMark酶標儀(Hercules,CA,USA);Eppendorf Centrifugal 5804R高速離心機(Hamburg,Germany).

1.3 HPLC方法

HPLC流動相:A相為水,用TFA調節(jié)pH值為2.5;B相為含0.02%TFA的乙腈;溫度為30?C,流速為1 mL/min.梯度洗脫程序如表1所示.在這些條件下,SDB的保留時間為15.0 min.

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of HPLC

2 實驗方法

2.1 細胞實驗

L02細胞在含10%FBS,100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,于37?C在含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細胞處于對數生長期,生長至80%左右時,加入含有不同濃度CHB或CMHA的無FBS的DMEM培養(yǎng)基中,37?C孵育1 h.用冰冷的磷酸鹽(phosphate-buff ered saline,PBS)緩沖液洗兩次,刮下.在D-Hank’s緩沖液中吹散成細胞懸液(每5百萬個細胞用500μL緩沖液),超聲破碎,4?C,16 000 g離心10 min.離心后的上清液立即用MBB法檢測.

2.2 Bradford方法測定蛋白質

在200μL考馬斯亮藍溶液中加入10μL BSA或待測溶液,混合均勻后放置5 min.取180μL混合液置于96孔板中,用酶標儀在波長595 nm處測量吸光度.用0.1,0.2,0.3,0.4和0.5 mg/mL BSA溶液制備工作曲線.

2.3 MBB法測量樣品中H2S的濃度[11]

步驟 1 70μL pH=9.5 Tris緩沖液 (100 mmol/L,含 0.1 mmol/L DTPA)和 50μL 10 mmol/L MBB乙腈溶液混合,加入30μL樣品,暗處放置30 min.

步驟2 加入50μL 200 mmol/L SSA溶液,置于冰上10 min.

步驟3 4?C,11 000 r/min離心10 min.

步驟4 HPLC分析,熒光檢測(λex=390 nm,λem=475 nm).

2.4 統(tǒng)計分析

每個實驗中的待測樣品至少設置3個平行樣.用t-test檢驗數據的差異,p<0.05表明差異是統(tǒng)計顯著的.

3 結果與討論

3.1 MBB法的改進

Shen等[11]建立的MBB法,假定H2S容易被氧氣氧化,需要在無氧條件下進行反應,因此需要在手套箱中進行操作.然而根據化學反應原理,雖然H2S確實能夠被氧氣氧化,但該反應是動力學不利的.因為氧分子處于三重態(tài),而該反應涉及到兩個電子的轉移.實際上,已有多篇文獻研究過H2S與氧氣在水中氧化反應的動力學.例如,Millero等[13]發(fā)現(xiàn),在空氣飽和的海水(pH=8)中,H2S在25?C條件下被氧化的半衰期為26 h.Luther等[14]發(fā)現(xiàn),在空氣飽和的不含微量金屬離子的水中,在pH=12和25?C條件下,H2S被氧化的半衰期長達55 d.Olson等[10]也進行了相似的實驗,證明在通常實驗條件下H2S被氧化的速率非常慢.本工作也進行了一些簡單的檢驗,同樣表明H2S的氧化反應完全不影響實驗結果(數據略).因此,本工作中的所有實驗操作均未在手套箱中進行.

3.2 CMHA對細胞內源性H2S產生的抑制效應

為了檢驗改進后的MBB法是否能正確測量細胞裂解液中的H2S濃度,使用不同濃度(1,50,100和150μmol/L)的CMHA孵育L02細胞1 h,然后進行檢測.結果表明:CMHA確實會大大降低細胞內源性H2S的產生(見圖2和表2),測得的H2S濃度隨CMHA濃度的增加而降低,顯示了良好的濃度-效應關系.在不同濃度CMHA下獲得的數據都明顯低于對照組(即未使用CMHA的情況),且差異是統(tǒng)計顯著的(p<0.01,見圖2).

根據相關文獻報道,CMHA對CSE的抑制效應很強(其半抑制濃度IC50=1.09μmol/L),而對CBS的抑制效應稍弱(IC50=8.52μmol/L)[9],且肝臟中主要的內源性H2S產生途徑是通過CSE[6].本實驗結果與這些文獻報道吻合.由于CMHA的IC50為1.09μmol/L,因此1μmol/L CMHA就產生了明顯的抑制效應(與對照組相比,1μmol/L CMHA處理后的H2S濃度降低了27%,見表2),說明改進后的MBB法能夠很好地檢測細胞裂解液中的H2S濃度.

表2 不同濃度CMHA孵育L02細胞1 h后,用MBB法測得的H2S濃度Table 2 Concentrations of H2S obtained in L02 cells with the MBB assay after incubation with different concentrations of CMHA for 1 h

圖2 CMHA對L02細胞內源性H2S產生的抑制效應Fig.2 Inhibition of endogenous H2S production in L02 cells caused by CMHA

3.3 CHB對細胞內源性H2S產生的影響

用10,50和200μmol/L CHB孵育L02細胞1 h后,發(fā)現(xiàn)CHB也導致了細胞內源性H2S濃度的明顯降低,而且存在濃度-效應關系(見圖3和表3).與對照組相比,10μmol/L的CHB可使細胞內源性產生的H2S濃度降低一半(見表3).經過統(tǒng)計分析,差異是統(tǒng)計顯著的(p<0.01,見圖3).50和200μmol/L CHB可使H2S的濃度進一步降低,但降低的幅度變得較為緩慢(見圖3).

表3 不同濃度CHB孵育L02細胞1 h后,用MBB法測得的H2S濃度Table 3 Concentrations of H2S obtained in L02 cells with the MBB assay after incubation with different concentrations of CHB for 1 h

圖3 CHB對L02細胞內源性H2S產生的影響Fig.3 Eff ect of CHB on endogenous H2S production in L02 cells

在本實驗中,細胞毒性是一個很重要的因素.如果外源性化合物的濃度過高,引起細胞死亡(凋亡或壞死),則觀察到的H2S濃度降低可能是細胞死亡的結果.然而,Liu等[15]已經發(fā)現(xiàn),對于L02細胞,即使CHB的濃度增加到1 000μmol/L都沒有顯示細胞毒性,因此本實驗中觀察到的現(xiàn)象表明CHB對細胞內源性H2S產生具有明顯的抑制效應.這一發(fā)現(xiàn)對CHB及其前體1,3-丁二烯的毒理學研究具有重要意義.由于H2S是細胞內生理活動的一個樞紐,涉及到無數生理功能,因此抑制內源性H2S的產生可能涉及多種疾病,也可能是CHB和1,3-丁二烯毒性效應機理的一個重要方面.當然,CHB抑制效應的分子機制尚不清楚,需要進一步的研究.

4 結束語

由于1,3-丁二烯的主要環(huán)境來源是機動車尾氣和香煙煙霧,因此它是一種廣泛存在的環(huán)境污染物,幾乎每個人都暴露于1,3-丁二烯的污染中.已知1,3-丁二烯本身并不是致癌物,其致癌性必須通過代謝活化,即1,3-丁二烯的致癌性源于其代謝產物.在氣體第二信使分子中,H2S是最新的一個信號分子,關于H2S的研究也呈指數增長趨勢,已經成為生物學研究的一個熱點領域.本工作將1,3-丁二烯代謝產物與細胞內源性H2S的產生相關聯(lián),發(fā)現(xiàn)CHB能夠明顯抑制細胞內源性H2S的產生,具有重要意義.實驗結果有助于更深地理解1,3-丁二烯在分子水平上的毒性機理,并且形成進一步深入研究的起點.