鄭海英,黃玥萌,楊春艷，鄢勝飛，李孟琪，于農(nóng)淇，鄭 威，黃加祥，尚江華

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所/農(nóng)業(yè)部(廣西)水牛遺傳繁育重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

p21作為一種可調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、衰老和死亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤、癌癥也有密切關(guān)系[1]。p21蛋白通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖、衰老和死亡[2]。當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，p21使細(xì)胞停滯于G1期，甚至G2期，使細(xì)胞有時(shí)間對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，從而維持細(xì)胞遺傳信息的穩(wěn)定性[3]。但另一方面，細(xì)胞周期的停滯是衰老的前提，若細(xì)胞內(nèi)p21增加，則足以引起細(xì)胞衰老[4]。自p21被證明對(duì)細(xì)胞周期具有負(fù)調(diào)控作用以來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)p21參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，其表達(dá)使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡；同時(shí)，p21調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡過(guò)程，若缺失或突變會(huì)使細(xì)胞分裂復(fù)制、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的運(yùn)輸及通訊功能喪失，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡或被其他細(xì)胞清除[5]。此外，p21在正常組織中的表達(dá)也已有大量報(bào)道。Guo Q等[6]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的p21使干細(xì)胞停滯于G1期；而干擾p21后干細(xì)胞出現(xiàn)明顯的DNA損傷和細(xì)胞凋亡。在卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育過(guò)程中，p21的作用受到了許多關(guān)注。Moore G D等[7]檢測(cè)了小鼠卵母細(xì)胞p21的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)在無(wú)減數(shù)分裂能力的卵母細(xì)胞、有減數(shù)分裂能力的卵母細(xì)胞以及停滯于M-Ⅱ期的卵母細(xì)胞中，p21的表達(dá)量無(wú)顯著差異；而在胚胎發(fā)育的第2次有絲分裂的G2期，p21的表達(dá)量會(huì)較第1次有絲分裂驟增2倍～3倍。p21蛋白的表達(dá)以及亞細(xì)胞定位均可影響小鼠受精卵G2期向M期的轉(zhuǎn)換[8]。在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，當(dāng)胚胎細(xì)胞快速增殖時(shí)，p21只有極弱的特異性表達(dá)信號(hào)；而當(dāng)胚胎器官基本形成后，p21的表達(dá)信號(hào)增強(qiáng)，有利于抑制這些細(xì)胞的增殖速度，使細(xì)胞轉(zhuǎn)入進(jìn)一步的分化[9]。在小鼠卵泡的生長(zhǎng)、成熟和閉鎖過(guò)程中，p21在卵母細(xì)胞中也發(fā)揮了一定的作用，參與優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇和形成[10]。

目前，關(guān)于p21與卵母細(xì)胞體外成熟減速分裂核進(jìn)程的研究已涉及小鼠、牛、山羊等多個(gè)物種，趙貴民等[11]已在牛卵母細(xì)胞成熟的不同時(shí)期均檢測(cè)到p21 mRNA的表達(dá)。水牛是我國(guó)南方奶業(yè)的重要優(yōu)勢(shì)品種，了解p21基因在水牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律和相關(guān)功能，為提高水牛胚胎體外生產(chǎn)提供分子生物學(xué)理論和試驗(yàn)依據(jù)，對(duì)加快奶水牛品種改良具有重要意義。本研究通過(guò)檢測(cè)水牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中p21的表達(dá)并構(gòu)建pEGFP-N1-p21真核表達(dá)載體，為研究p21在水牛卵母細(xì)胞體外成熟中的作用機(jī)制及下一步生產(chǎn)轉(zhuǎn)p21基因水牛奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水牛顆粒細(xì)胞和卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物 水牛顆粒細(xì)胞：通過(guò)對(duì)摩拉水牛進(jìn)行活體采卵，所得的活采液被放置于體式顯微鏡下，挑揀出水牛卵母細(xì)胞后，將剩余的活采液進(jìn)行離心，收集其中的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、分離和傳代，所得細(xì)胞即為顆粒細(xì)胞。水牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體由屠宰場(chǎng)水牛卵巢抽取獲得。

1.1.2 載體與感受態(tài)細(xì)胞 pEGFP-N1載體和DH5α感受態(tài)細(xì)胞，由廣西水牛研究所遺傳繁育重點(diǎn)試驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 RNAiso Plus、Hind Ⅲ、KpnⅠ、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)、SYBR? Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0、pMD19-T，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；ReverTra Ace-α-?、ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover，Toyobo-東洋紡(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒，天根化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；無(wú)內(nèi)毒質(zhì)粒小量提取試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；Cell-to-cDNA Ⅱ Kit、T4 DNA Ligase Kit、LipofectamineTM3000 Transfection Kit、DMEM、FBS、Amp+和Kna+，Life公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[12]的引物(p21-F：5′-ATCGAAGCTTACAGGTGCCATGTCTGAGCTGT-3′；p21-R：5′-ATCGGGTACCGCGGG- CTTCCTCCTGGAGCAGAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物521 bp)，擴(kuò)增水牛p21 CDs區(qū)，并在上下游引物中加入Hind Ⅲ、KpnⅠ酶切位點(diǎn)(劃線部分為對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn))。同時(shí)參考GenBank中水牛p21 基因mRNA (NM-001098958.2) 序列，利用NCBI primer blast設(shè)計(jì)RT-qPCR檢驗(yàn)擴(kuò)增引物(F:5′-GAGCGGTGGAACTTCGACTT-3′；R：5′-CAAGTGGTCCTCCTGAGACG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物186 bp)。內(nèi)參基因選擇β-actin(F:5′-AGCTCGCCATGGATGATGA-3′，R:5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物166 bp)。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2.2 水牛卵丘-卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng) 從南寧市屠宰場(chǎng)收集水牛卵巢，置于30℃～35℃的生理鹽水中3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用 9 g/L的雙抗生理鹽水沖洗3次。用注射器抽取直徑為2 mm～8 mm的水牛卵泡液，在體視顯微鏡下用玻璃吸管吸取卵泡液中帶2層以上卵丘細(xì)胞、胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞，在洗卵液(含5 g/L NBS、20 mmol/L Hepes的TCM199)中洗2次，再在經(jīng)平衡過(guò)的IVM液(TCM199+100 mL/LFBS+10 μg/mL FSH +12 μg/mL LH+1 μg/mL E2+50 μmol/L巰基乙醇)中洗3次，最終放入干凈的IVM液中，收集IVM不同時(shí)期水牛卵母細(xì)胞。

1.2.3 卵母細(xì)胞p21 mRNA表達(dá)檢測(cè) 按照Cell-to-cDNATMⅡ Kit的說(shuō)明書收集體外成熟不同時(shí)期的水牛卵母細(xì)胞40個(gè)～50個(gè)，用4℃ 1×PBS清洗卵母細(xì)胞3遍后，放入10 μL 4℃ Cell Lysis Ⅱ buffer，75℃孵育10 min。冰上冷卻后加入DNase Ⅰ，使其終濃度為0.04 U/μL。37℃孵育15 min后75℃孵育5 min使DNaseⅠ失活。再向裂解液中加入4 μL dNTP Mix，2 μL Random Decamers，70℃孵育3 min后向其加入2 μL 10×RT buffer，1 μL M-MLV Reverse Transcriptase，1 μL RNase Inhibitor，42℃ 30 min，95℃ 10 min后直接獲得cDNA，以其為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。RT-qPCR反應(yīng)體系為：SYBR? Premix ExTaqTM5.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.0 μL，共10.0 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 cycles；95℃ 5 s，60℃ 60 s，95℃延伸，讀取熔解曲線。熒光信號(hào)由Loche LightCycler 480采集并分析，利用RQ=2-ΔΔCt方法計(jì)算p21的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 RT-PCR擴(kuò)增p21 CDs 按照RNAiso Plus說(shuō)明書提取摩拉水牛卵巢顆粒細(xì)胞總RNA。按照ReverTra Ace-α-?說(shuō)明書，以摩拉水牛卵巢顆粒細(xì)胞總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴(kuò)增反應(yīng)體系：PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0) 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上、 下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，RNase free H2O 7.0 μL，總體積 20.0 μL。反應(yīng)程序：98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35 cycles；72℃ 5 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0說(shuō)明書回收PCR產(chǎn)物。

1.2.5 重組質(zhì)粒pMD19-T-p21的構(gòu)建 將回收的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T連接，反應(yīng)體系：pMD19-T Vector 1.0 μL，回收PCR產(chǎn)物4.0 μL，Solution 5.0 μL，共10.0 μL。16℃孵育30min后轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落用Amp+抗性篩選后進(jìn)行菌液PCR和測(cè)序驗(yàn)證。連接后的重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-p21。按照質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書提取pMD19-T-p21質(zhì)粒備用。

1.2.6 真核表達(dá)載體pEGFP-N1-p21的構(gòu)建 用Hind Ⅲ和KnpⅠ分別雙酶切 pMD19-T-p21質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒后，利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 回收線性化載體。按照 T4 DNA Ligase Kit說(shuō) 明 書 將 線 性 化 pEGFP-N1與p21 CDs連接。 反應(yīng)體系：線性化pEGFP-N1 1 μL(100 ng)，p21 CDs 6 μL(≈500 ng)，10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL，T4 DNA Ligase 1 μL(1 U)，ddH2O 10 μL，共 20.0 μL。22℃孵育30 min 。連接后的重組質(zhì)粒命名為 pEGFP-N1-p21。轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落用Kna+抗性篩選后進(jìn)行菌液PCR。將PCR結(jié)果為陽(yáng)性的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后按照天根質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。酶切體系：質(zhì)粒 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL，KpnⅠ 1 μL，10×Fast Digest Green Buffer 2 μL，ddH2O 15 μL，共20 μL。37℃孵育20 min，80℃孵育10 min，終止反應(yīng)。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)酶切結(jié)果。將酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，按照 Omega無(wú)內(nèi)毒質(zhì)粒小量提取試劑盒說(shuō)明書提取pEGFP-N1-p21質(zhì)粒備用。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng) 將保存于液氮的水牛卵巢顆粒細(xì)胞取出后立即放入37℃水浴中，緩慢搖動(dòng)凍存管，在1 min內(nèi)將其融化完全，2000 r/min離心2 min，去除上層凍存液，加入500 μL 90%DMEM+10%FBS 完全培養(yǎng)基，輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞混勻，再轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待其融合度達(dá)90%后以5×105/孔的密度傳代于6孔板中，待融合度達(dá)80%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

1.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將提取的無(wú)內(nèi)毒pEGFP-N1-p21及pEGFP-N1質(zhì)粒稀釋至濃度1 μg/μL，與空白對(duì)照(無(wú)質(zhì)粒)同時(shí)按LipofectamineTM3000 Transfection Kit說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h和48 h用倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。

1.2.9 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中p21基因RT- qPCR檢測(cè) 提取水牛卵巢顆粒細(xì)胞總RNA，按照ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover說(shuō)明書制備cDNA。RT-qPCR反應(yīng)體系為：SYBR? Premix ExTaqTM10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 5.0 μL，ddH2O 4.0 μL，共20.0 μL。反應(yīng)程序同1.2.2。熒光信號(hào)由Loche LightCycler 480采集并分析，利用 RQ=2-ΔΔCt方法計(jì)算p21的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 水牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中p21的表達(dá)

按照Cell-to-cDNATMⅡ Kit的說(shuō)明書收集體外成熟不同時(shí)期的水牛卵母細(xì)胞40個(gè)～50個(gè)，直接獲得cDNA，以其為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。P21 mRNA相對(duì)表達(dá)情況如表1。以水牛卵母細(xì)胞p21在體外成熟培養(yǎng)0 h為基準(zhǔn)，在培養(yǎng)6 h時(shí)p21表達(dá)量最高，與其他時(shí)期的差異極顯著(P<0.01)，隨后p21表達(dá)量降低，12 h～24 h之間無(wú)明顯差異。有極體的卵母細(xì)胞p21表達(dá)量顯著高于無(wú)極體的卵母細(xì)胞(P<0.05)。

2.2 p21基因RT-PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄所得的水牛顆粒細(xì)胞cDNA為模板，用引物p21-F和p21-R擴(kuò)增，目的片段用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，可見一條近500 bp的單一條帶(圖1)。

表1 水牛卵母細(xì)胞體外成熟各時(shí)期p21相對(duì)表達(dá)量

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著。

Note：Values within the same column with different capital letters are extremely significantly different (P<0.01), with different small letters are significantly different(P<0.05),and with same letters are not significantly different.

2.3 重組質(zhì)粒鑒定及序列測(cè)定

按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0說(shuō)明書回收PCR 產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆菌用Amp+進(jìn)行抗性篩選，菌液PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖2所示，可觀察到大部分菌液樣品均有接近500 bp大小的單一目的條帶。

將陽(yáng)性菌液的測(cè)序結(jié)果與牛p21基因(NM-001098958.2)序列對(duì)比，同源性達(dá)99%。如圖3所示，水牛p21 cDNA序列與參考基因相比存在5處突變。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2. p21-F和 p21-R PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control ；2.Products of p21-F and p21-R

圖1水牛顆粒細(xì)胞p21 PCR產(chǎn)物

Fig.1 PCR products of p21-F and p21-R

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～7. pMD19-T-p21菌液PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000；1-7. PCR products of pMD19-T-p21 bacterial liquid

圖2 pMD18-T-p21菌液PCR

Fig.2 PCR identification of pMD18-T-p21 bacterial liquid

圖3 測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果

2.4 真核表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果

用Hind Ⅲ和KnpⅠ分別雙酶切 pMD19-T-p21質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒后，利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0 回收線性化載體。按照 InvitrogenTMT4 DNA Ligase說(shuō)明書將線性化pEGFP-N1與p21 CDs連接。連接后的重組質(zhì)粒命名為 pEGFP-N1-p21。轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌用Kna+進(jìn)行抗性篩選，將菌液 PCR結(jié)果為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后將酶切產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖4所示，可觀察到質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ酶切后條帶大小正確。

2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染水牛顆粒細(xì)胞

pEGFP-N1-p21、pEGFP-N1和陰性對(duì)照同時(shí)操作轉(zhuǎn)染水牛顆粒細(xì)胞，于24 h和48 h在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光。24 h熒光表達(dá)如圖5所示，陰性對(duì)照組未觀察到綠色熒光；pEGFP-N1-p21、pEGFP-N1均有綠色熒光蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)重復(fù)3次，均得到一致結(jié)果，表明重組質(zhì)粒pEGFP-N1-p21成功轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞中并表達(dá)出綠色熒光蛋白，證明pEGFP-N1-p21真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中p21基因RT-qPCR檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染48 h后的水牛顆粒細(xì)胞提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行RT- qPCR檢測(cè)，p21表達(dá)情況如圖6。在空白對(duì)照p21表達(dá)量與pEGFP-N1差異不顯著，與pEGFP-N1-p21差異極顯著；pEGFP-N1與pEGFP-N1-p21差異極顯著(P<0.01)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000；1. pEGFP-N1-p21雙酶切；2.Hind Ⅲ酶切pEGFP-N1-p21；3.KpnⅠ酶切pEGFP-N1-p21

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000；1.Double enzyme digestion of pEGFP-N1-p21;2.pEGFP-N1-p21 digested withHind Ⅲ；3.pEGFP-N1-p21 digested withKnpⅠ

圖4 pEGFP-N1-p21雙酶切結(jié)果

Fig.4 Double enzyme digestion results of pEGFP-N1-p21

A.pEGFP-N1-p21轉(zhuǎn)染;B.pEGFP-N1轉(zhuǎn)染;C.空白對(duì)照；A’、B’、C’.對(duì)應(yīng)明場(chǎng)

A.pEGFP-N1-p21 transfection;B.pEGFP-N1 transfection;C.Blank control；A’,B’,C’.Transfection with pEGFP-N1-p21,pEGFP-N1 and blank under the common light respectively

圖5綠色熒光蛋白表達(dá)情況

Fig.5 Expression of green fluorescent protein

與對(duì)照組比較，**表示差異極顯著(P<0.01)

Compared with control group( **P<0.01)

圖6顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

Fig.6 Transfection efficiency of ovarian granulosa cells

3 討論

p21在卵子成熟過(guò)程中的作用在多年前已有大量研究。Frank-Vaillant M等[13]對(duì)爪蟾卵子的研究提示高水平p21蛋白可間接誘導(dǎo)卵子減數(shù)分裂G2/M期轉(zhuǎn)換受到阻滯。許曉磊[14]將牛pVenus-p21真核表達(dá)載體的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物注射入體外成熟培養(yǎng)8 h的牛卵母細(xì)胞中，使得牛卵母細(xì)胞成熟率出現(xiàn)明顯降低；而在對(duì)卵子內(nèi)p21進(jìn)行干擾后發(fā)現(xiàn)牛卵母細(xì)胞成熟率上升。趙貴民[12]在mRNA水平上分析了牛p21在減數(shù)分裂和胚胎發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)p21在MⅠ期和MⅡ期的表達(dá)量逐漸升高，進(jìn)入胚胎發(fā)育階段后表達(dá)量下降，到8細(xì)胞期后又再次上升，到達(dá)囊胚期時(shí)表達(dá)量最高。本研究在水牛卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的0、6、12、24 h分別對(duì)其檢測(cè)了p21 mRNA的表達(dá)水平，在6 h時(shí)p21 mRNA的表達(dá)量最高，可能是由于在6 h之前卵母細(xì)胞大多數(shù)仍處于GV期，此時(shí)卵母細(xì)胞正被阻滯在第1次減數(shù)分裂前期的雙線期，這正是p21高表達(dá)的結(jié)果。隨后p21表達(dá)量急劇降低，并從12 h～24 h p21表達(dá)量有緩慢上升的趨勢(shì)，但差異不顯著。IVM前12 h是水牛卵母細(xì)胞GVBD的發(fā)生時(shí)期，其間卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂并進(jìn)入MⅠ期。后12 h卵母細(xì)胞從MⅠ期隨第1極體的排出進(jìn)入MⅡ期。此時(shí)卵母細(xì)胞又進(jìn)入停滯期，直到受精或給予適當(dāng)刺激時(shí)才能解除停滯并恢復(fù)第2次減數(shù)分裂[15]。故而本研究檢測(cè)到的水牛卵母細(xì)胞體外成熟的12 h～24 h期間p21的表達(dá)量與上述的規(guī)律基本符合，與趙貴民的研究結(jié)果一致。此外，本研究檢測(cè)到在排出了第1極體的卵母細(xì)胞中，p21 mRNA的表達(dá)量顯著高于未排出第1極體的卵母細(xì)胞(P<0.05)，這也可能是由于這些未排出第1極體的卵母細(xì)胞在G2/M轉(zhuǎn)換的過(guò)程中受到某些干擾而未能按時(shí)完成第1次減數(shù)分裂。

屠宰場(chǎng)來(lái)源水牛卵巢的卵母細(xì)胞GVBD的發(fā)生具有不均一性[16]，是導(dǎo)致體外生產(chǎn)水牛胚胎成功率顯著降低的重要原因。而在本研究中，p21在GVBD時(shí)期(IVM前12 h)的表達(dá)發(fā)生了較大變化，這樣的變化是否對(duì)卵母細(xì)胞的成熟率、受精后的分裂率等有影響還需更進(jìn)一步的研究。Shang J H等[17]已成功從水牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)中克隆出p21 CDs，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。本研究在其基礎(chǔ)上從摩拉水牛顆粒細(xì)胞中克隆出p21 CDs并構(gòu)建出pEGPF-N1-p21真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染水牛顆粒細(xì)胞后可見綠色熒光，且p21 mRNA的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，既可表達(dá)綠色熒光蛋白，也可轉(zhuǎn)錄出p21 mRNA。p21蛋白的表達(dá)量還需后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。本研究為進(jìn)一步研究p21在水牛卵母細(xì)胞體外成熟以及胚胎發(fā)育過(guò)程中的相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。