內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院 010018 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 010018

內(nèi)蒙古是一個奶牛生產(chǎn)地帶，近幾年來奶牛的數(shù)量不斷增長，使奶牛生存的環(huán)境衛(wèi)生日益惡化。常年發(fā)生蚊和蠅等雙翅目昆蟲的侵襲，誘發(fā)奶牛應激反應，導致神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂、免疫力下降和重大疾病流行，使奶牛業(yè)的發(fā)展受到很大制約[1]。

雙翅目昆蟲作為奶牛場中的主要應激源，侵襲強度過大或作用時間過長時，奶牛機體就會逐漸失去應付能力，出現(xiàn)病理狀態(tài)。當機體遭遇冷、熱和饑餓刺激時，會同時引起交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎上腺機能增強，表現(xiàn)出交感-腎上腺髓質系統(tǒng)亢進，髓質分泌大量腎上腺素（E）和去甲腎上腺素（NE），引起應激反應[2.3]。有研究表明，奶牛受到長時間的冷熱應激后，血清中促腎上腺皮質激素（ACTH）和皮質醇（COR）含量與非應激期相比無顯著性差異，甚至有低于非應激期的趨勢[4]。大多數(shù)研究認為，應激對免疫系統(tǒng)有抑制作用，應激和免疫之間的關系還受性別、年齡和心理因素等個體因素影響[5]。應激時，機體在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)協(xié)同作用下，進行一系列的免疫調(diào)節(jié)[6]。所以，應激影響神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡。

本試驗通過研究奶牛受到雙翅目昆蟲的侵襲時，奶牛內(nèi)分泌激素及免疫力的變化規(guī)律，論證雙翅目昆蟲侵襲時奶牛的應激反應。為進一步緩解昆蟲對奶牛應激的技術措施提供理論依據(jù)。

1 材料

（1）試驗動物及管理。按胎次、產(chǎn)奶量和年齡相近的原則，以舍飼奶牛場飼養(yǎng)的9頭健康荷斯坦奶牛作為試驗對象。 牛群擠奶時間為上午 5∶30，下午 17∶30，日擠奶 2 次。飼料給予時間為上午 7∶00～9∶00，中午 13∶30～15∶30，晚上 19∶00～21∶00，共 3 次。 自由采食青干草和飲水。其余時間牛在運動場自由活動或休息。

（2）血樣的采集與預處理。每個試驗月采1次血液樣品，在雙翅目昆蟲活動最頻繁的時間段，用普通真空采血管和抗凝真空采血管頸靜脈采集血樣，離心分離血清和血漿，帶回實驗室-20℃保存待檢測。

（3）主要試劑。 一抗：CD3 Moab Ascites fluid Ig G1 isotype；CD4 Mo Ab Ascites fluid Ig G1 isotype；CD8 Mo Ab Ascites fluid Ig M isotype；CD21 Moab Ascites fluid Ig M isotype。 二抗：Fluor escein(Fitc)Anti Mouse Ig M；Goat Anti Mouse Ig G1,Iluman ads FITC（一抗與二抗都是PO Box 502,Pullman,WA 99163 USA 公司提供）。

（4）試驗器材。離心機（型號為Multifuge）購自美國Thermo Scientific Heraeus公司，酶標儀 （型號為Thermo NANODROP 2000c）購自美國Thermo Scientific Heraeus公司，恒溫生化培養(yǎng)箱（型號為ZXSD-B1090）購自上海智城公司，流式細胞儀(型號為FACSSalibur)購自美國BD公司，移液槍（型號為TopPette）購自北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司。

2 方法

（1）雙翅目昆蟲侵襲時奶牛內(nèi)分泌激素水平的影響。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒法，測定血清中的內(nèi)分泌激素相關指標。測定的激素指標為促腎上腺皮質激素（ACTH）、生長激素(GH）、皮質醇（COR）、泌乳素 （PRL）和去甲腎上腺素 （NE），試驗步驟按照ELISA試劑盒說明書進行。試劑盒均購自北京城林生物科技有限公司。

（2）雙翅目昆蟲侵襲時對奶牛免疫機能的影響。采用流式細胞儀測定奶牛外周血淋巴細胞及其亞群的影響。

測定方法：每個管中用移液器移取40uL抗凝血，迅速加入10倍稀釋后的800uL溶血素，輕輕震勻，靜置12分鐘，1500rpm離心400秒，棄上清；加入300μL PBS緩沖溶液，清洗2次，離心后棄上清；加入200uLPBS稀釋，然后按(50uL/份)分成 4等份,分別加入淋巴細胞熒光標記CD3/FITC-IgG1、CD4/FITC-IgG1、CD8/FITC-IgM和CD21/FITC-IgM，避光低溫孵育30分鐘后離心棄上清，再加入200uL PBS，漩渦震蕩使細胞懸浮，流式細胞儀上獲取10000個細胞，檢測其中 CD3+T、CD4+T、CD8+T和 CD21+B細胞的所占百分數(shù)。

（3）統(tǒng)計學分析。采用Excel和SAS9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。使用方差分析對試驗結果進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

3 結果與分析

（1）雙翅目昆蟲侵襲時對奶牛內(nèi)分泌激素水平的影響。雙翅目昆蟲侵襲對奶牛血清激素水平的影響見表1。從表1可見，雙翅目昆蟲活動期，奶牛血清中的ACTH含量6月極顯著高于7月，顯著高于8月和9月，6月和 10月間無顯著差異（P＞0.05）；血清中 COR含量各試驗月間差異顯著（P＜0.05），但是從6月以后，至7月和8月份有下降趨勢，9月開始回升；血清中GH含量6月極顯著高于7月和8月，顯著高于9月，但與10月差異不顯著（P＞0.05）；血清中PRL含量6月顯著高于7月和8月（P＜0.05），但是9月和10月無明顯差異（P＞0.05）；血清中NE含量7月顯著高于6月、9月和10 月（P＜0.05），與 8 月間差異不顯著（P＞0.05）。

表1 雙翅目昆蟲侵襲時奶牛血清中激素水平的變化

（2）奶牛血液淋巴細胞的變化。奶牛血液中淋巴細胞（%）水平見表2，奶牛血液淋巴細胞（%）分析圖見圖1～圖4。由表2可知，雙翅目昆蟲的侵襲對荷斯坦奶牛血液CD3+T淋巴細胞（%）水平的影響規(guī)律是從 6月 74.63±7.21%顯著下降至7月55.29±1.76%，一直持續(xù)到 10 月 50.82±1.49%的水平（P＜0.05）；血液 CD4+T淋巴細胞（%）水平的影響規(guī)律是從6月59.21±2.10%顯著下降至7月40.75±2.14%，一直持續(xù)到10月33.87±3.46%的水平（P＜0.05）；血液 CD8+T 淋巴細胞（%）水平的影響規(guī)律是從6月13.05±0.89%顯著提高至 7月35.73±1.14%，一直持續(xù)到9月21.09±1.19%的水平（P＜0.05），10 月下降至 15.07±1.65%，與 6 月相比差異不顯著（P＞0.05）；奶牛血液 CD21+B 淋巴細胞（%）水平的影響規(guī)律是從6月29.44±1.22%顯著下降至8月23.64±1.59%，而從9月顯著提高至34.45±2.15%的水平（P＜0.05），持續(xù)至 10 月。

表2 奶牛血液淋巴細胞變化（%）

圖1 奶牛血液CD3+T淋巴細胞（%）的二維點陣

圖2 奶牛血液CD4+T淋巴細胞（%）分析圖

圖3 奶牛血液CD8+T淋巴細胞（%）分析圖

圖4 奶牛血液CD21+B淋巴細胞（%）分析圖

4 討論

（1）雙翅目昆蟲侵襲對荷斯坦奶牛血液內(nèi)分泌激素水平的影響。應激時糖皮質激素的分泌加強是通過下丘腦-垂體前葉-腎上腺皮質軸（HPA）相互作用而實現(xiàn)的。大量研究表明，機體發(fā)生急性應激反應時增高HPA軸興奮性，從而促進ACTH釋放，引起長時間的皮質醇水平升高，使有生物學活性的游離皮質醇有充分的時間作用于靶器官，增強或抑制靶器官的功能[7]。但是隨著應激時間的延長，皮質醇濃度會逐漸降低，甚至低于基礎濃度，說明皮質醇的合成在逐漸減少。皮質醇在體內(nèi)參與機體的應激反應,并調(diào)節(jié)三大代謝,是維持許多組織器官正常活動所必需的,具有抗炎和抗免疫等作用[8-9]。西伯利亞鱘熱應激初期時血清皮質醇含量迅速升高,之后快速回落[10]。本試驗結果表明，雙翅目昆蟲開始侵襲的6月，奶牛血清中ACTH和COR水平較高，而在雙翅目昆蟲頻繁侵襲的7月，奶牛血清中ACTH和COR水平下降，一直持續(xù)至9月，與上述研究結果較一致。由此認為，在雙翅目昆蟲活動期，特別是雙翅目昆蟲頻繁侵襲奶牛時期，對奶牛內(nèi)分泌產(chǎn)生一定的影響，長期昆蟲侵襲產(chǎn)生的應激反應對奶牛血清中ACTH和COR的水平具有抑制作用。

GH主要的生理功能是促進物質代謝和生長發(fā)育，還參與機體的應激反應。運動、饑餓及應激侵襲均可引起GH分泌增多。PRL主要的生理作用是促進乳腺的發(fā)育并維持泌乳。應激狀態(tài)下，血液中PRL與ACTH和GH的濃度同時增加，共同參與應激反應。呂曉偉[4]的研究表明，冷熱應激期間奶牛血清中GH和PRL的含量顯著低于非應激期。本試驗結果也證實，雙翅目昆蟲開始侵襲的6月，奶牛血清中GH和PRL水平較高，在雙翅目昆蟲頻繁侵襲的7月，奶牛血清中GH和PRL水平下降，一直持續(xù)至9月。由此認為，在雙翅目昆蟲活動季節(jié)，特別是雙翅目昆蟲頻繁侵襲奶牛時，對奶牛內(nèi)分泌產(chǎn)生一定的影響，長期昆蟲侵襲產(chǎn)生的應激反應對奶牛血清中GH和PRL的水平具有抑制作用。當機體受到強烈侵襲時，就會出現(xiàn)以交感神經(jīng)興奮、兒茶酚胺分泌增多的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應，以適應強烈侵襲，提高機體抗病的能力。應激可以促使交感神經(jīng)和腎上腺髓質活動的加強，使血液中NE水平升高[11]。本試驗結果表明，在雙翅目昆蟲頻繁侵襲的7月和8月，奶牛血清中NE水平明顯提高，9月開始下降。由此推測為，在雙翅目昆蟲頻繁侵襲奶牛期間，昆蟲侵襲產(chǎn)生的應激反應對奶牛血清中NE水平具有促進作用。

（2）雙翅目昆蟲侵襲對奶牛細胞免疫及體液免疫力的影響。研究者認為，一些動物實驗及人體觀察證實，長期冷應激對免疫功能的影響主要是抑制性的[6]。目前已知CD3分子能夠表達于全部T細胞上，是T細胞共同的表面標志，因此它是鑒定T細胞的重要標記，CD3+T淋巴細胞降低提示細胞免疫機能降低或受抑制。CD4存在于輔助性T細胞表面，CD8存在于細胞毒性T細胞表面。CD4+T細胞含量高時，當外源性病原微生物侵入體內(nèi)時能夠很快啟動免疫反應，從而抵抗病原，表明機體免疫功能強，不易被疾病感染。CD8+T細胞含量高時，能識別被感染的細胞越多，表明機體本身的免疫功能降低，需要外來疫苗來抵抗病原。CD21+B淋巴細胞代表機體體液免疫力的強弱，CD21+B淋巴細胞降低，機體體液免疫力下降或受到抑制。應激侵襲可降低大鼠血液中CD3和CD4細胞的百分率，而CD8百分率提高，說明產(chǎn)生應激時大鼠細胞免疫功能降低[12]。慢性冷熱應激期CD3+T淋巴細胞（%）和CD21+B淋巴細胞（%）都顯著降低，使奶牛的免疫能力下降[13]。本研究結果表明，在雙翅目昆蟲活動季節(jié)，雙翅目昆蟲的侵襲對奶牛血液CD3+T、CD4+T和CD21+B淋巴細胞（%）水平的影響是從6月的最高下降至7月和8月的最低值，CD3+T和CD4+T一直持續(xù)到10月。同時，雙翅目昆蟲的侵襲對奶牛血液CD8+T淋巴細胞（%）水平的影響是從6月提高至7月的最高值，持續(xù)到8月。由此認為，CD3+T和CD4+T淋巴細胞降低表明雙翅目昆蟲的侵襲，會降低或抑制奶牛細胞免疫機能。CD8+T細胞含量的提高，能識別被感染的細胞越多，表明雙翅目昆蟲的侵襲，降低奶牛機體本身的免疫功能，需要疫苗來抵抗病原。CD21+B淋巴細胞降低表明雙翅目昆蟲的侵襲，能降低或抑制奶牛機體體液免疫力。

綜上所述，在雙翅目昆蟲活動期，特別是雙翅目昆蟲頻繁侵襲奶牛時期，對奶牛HPA軸產(chǎn)生一定的影響。而且長期昆蟲侵襲產(chǎn)生的應激反應對奶牛血清中ACTH、COR、GH和PRL的水平具有抑制作用，而對奶牛血清中NE水平具有促進作用。雙翅目昆蟲的侵襲，能夠降低或抑制奶牛細胞免疫機能及體液免疫力。同時降低奶牛機體本身的免疫功能，需要疫苗來抵抗病原。