西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 730030 西北民族大學(xué)化工學(xué)院 730030 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 730030

在脊椎動(dòng)物演化過(guò)程中，兩棲類(lèi)動(dòng)物是由水生到陸生的過(guò)渡型，其中很多物種具有食用或醫(yī)藥保健等價(jià)值，因此是重要的生物資源。

兩棲動(dòng)物的皮膚分泌液中含有大量能夠殺滅微生物、防御天敵的生物胺和活性多肽,其中生物胺與活性多肽的含量之高是哺乳類(lèi)動(dòng)物無(wú)可比擬的，因而被稱(chēng)為生物胺與活性多肽的巨大儲(chǔ)存庫(kù)。其皮膚分泌液中含有4大類(lèi)生物化學(xué)成分,即生物胺、蟾蜍配基、生物堿、多肽和蛋白質(zhì)[1]，其中最豐富的是抗菌肽。蛙皮抗菌肽于20世紀(jì)70年代被人們發(fā)現(xiàn)，但是一直沒(méi)有受到重視，直至從非洲爪蟾中提取出了蛙皮抗菌肽Magainins族，人們才開(kāi)始重視對(duì)抗菌肽的研究[2]。

1 材料及試劑

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。非洲爪蟾、蘭州地區(qū)的中國(guó)林蛙、中華大蟾蜍及花背蟾蜍。

（2）菌株。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌和紅色毛廯菌。

（3）溶液和培養(yǎng)基。①SDS-PAGE濃縮膠和分離膠的配制。配制12%分離膠5mL：去離子水1.6mL、30%丙烯酰胺 2.0mL、 1.5%Tris-HCl1.3mL、10%SDS 0.05mL、10%過(guò)硫酸銨 0.05mL(現(xiàn)配現(xiàn)用)、TEMED 0.002mL；配制5%濃縮膠2mL:去離子水1.4mL、30%丙 烯 酰 胺 0.33mL、1.0Tris-HCl0.25mL、10%SDS 0.02mL、10%過(guò)硫酸銨 (現(xiàn)配現(xiàn)用)0.02mL、TEMED 0.002mL。②液體培養(yǎng)基。NaCl5.0g、胰蛋白胨5.0g、酵母提取物2.5g，加入去離子水500mL，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙?，用濃度?mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，120℃高壓滅菌15分鐘。③LB固體培養(yǎng)基。向配制好的500mL液體培養(yǎng)基中加入7.5～10g瓊脂粉，120℃高壓滅菌15分鐘。

2 兩棲類(lèi)動(dòng)物皮膚分泌物的提取方法

（1）乙醚刺激。將活體非洲爪蟾、中國(guó)林蛙、中華大蟾蜍及花背蟾蜍的皮膚表面用超純水清洗干凈，用酒精棉球擦干凈，然后將其分別放置于1000mL燒杯中，滴加1mL的無(wú)水乙醚，蓋住燒杯口，使燒杯密閉，靜置1分鐘。這4種試驗(yàn)動(dòng)物均表現(xiàn)狂躁不安，奮力掙扎，最終麻醉昏迷。隨后取出4種試驗(yàn)動(dòng)物置于容器中，5分鐘后中國(guó)林蛙背部有少量的泡沫狀物質(zhì)分泌出來(lái)，非洲爪蟾的背部及后腿部有大量泡沫狀物質(zhì)分泌出來(lái)，花背蟾蜍的背部有淡黃色液滴狀物質(zhì)分泌出來(lái)，中華大蟾蜍背部皮膚處有泡沫狀物質(zhì)分泌出來(lái)，同時(shí)非洲爪蟾、中國(guó)林蛙、中華大蟾蜍及花背蟾蜍隨著分泌物產(chǎn)生的過(guò)程其皮膚顏色漸漸變淺。將提取出來(lái)的分泌物收集，保存到-20℃冰箱備用。

（2）腎上腺素刺激。將活體非洲爪蟾、中國(guó)林蛙、中華大蟾蜍及花背蟾蜍的皮膚表面用超純水清洗干凈，用酒精棉球擦干凈，分別給4種試驗(yàn)動(dòng)物背囊部注射鹽酸腎上腺素0.25mL。注射腎上腺素后非洲爪蟾的后背部立即有大量白色泡沫狀物質(zhì)分泌出來(lái)，花背蟾蜍的耳后腺處有淡黃色液滴分泌出來(lái)，而背部沒(méi)有分泌物，2分鐘后中國(guó)林蛙和中華大蟾蜍背部均有少量的泡沫狀物質(zhì)分泌出來(lái)，同時(shí)非洲爪蟾、中國(guó)林蛙及中華大蟾蜍隨著分泌物產(chǎn)生的過(guò)程其皮膚顏色漸漸變淺。將提取出來(lái)的分泌物收集，保存到-20℃冰箱備用。不同的提取方法適用于不同的兩棲類(lèi)動(dòng)物。在提取兩棲類(lèi)動(dòng)物皮膚分泌物前，了解該兩棲類(lèi)動(dòng)物皮膚屬于哪種類(lèi)型，最終采用與之匹配的提取方法。

3 皮膚分泌物體外抑菌性觀察

（1）方法。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌和紅色毛廯菌4種細(xì)菌分別接種于液體培養(yǎng)基中，放置于搖床上培養(yǎng)20小時(shí)。再將液體培養(yǎng)基中的菌液吸取50μL于含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用涂布棒涂抹均勻。每種菌液涂抹4個(gè)培養(yǎng)基，分別標(biāo)記1～4號(hào)，再將用乙醚方法刺激分泌的各種皮膚分泌物抗菌肽的粗提物吸取5μL分別滴加至1號(hào)培養(yǎng)皿中；將用去甲腎上腺素刺激分泌的各種皮膚分泌物抗菌肽吸取5μL分別滴加至2號(hào)培養(yǎng)皿中；3號(hào)培養(yǎng)皿中分別滴加5μL滅菌水；4號(hào)培養(yǎng)皿作為對(duì)照。將上述培養(yǎng)皿置于溫箱中培養(yǎng)12小時(shí)和24小時(shí)，觀察其抑菌效果。

（2）結(jié)果。見(jiàn)表1和表2。

表1 乙醚方法提取的兩棲動(dòng)物皮膚分泌物抑菌活性

表2 腎上腺素方法提取的兩棲動(dòng)物皮膚分泌物抑菌活性

（3）結(jié)論。通過(guò)對(duì)非洲爪蟾、蘭州地區(qū)的中國(guó)林蛙、中華大蟾蜍及花背蟾蜍4種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚分泌物的體外抑菌作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾的抑菌效果相對(duì)于其他3種動(dòng)物更好，并且兩棲類(lèi)動(dòng)物皮膚分泌物對(duì)細(xì)菌及真菌都有較好的抑菌效果。不同的刺激方法提取出來(lái)的抗菌肽粗提物的抑菌效果也有細(xì)微的差異。由于非洲爪蟾皮膚分泌物不僅量多，而且抑菌效果較好，因此對(duì)非洲爪蟾皮膚分泌物中抗菌肽需做進(jìn)一步的研究。

4 非洲爪蟾皮膚分泌物SDS-PAGE檢測(cè)

（1）SDS-PAGE檢測(cè)方法。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)可根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別分離蛋白質(zhì),并可測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。經(jīng)制備凝膠、點(diǎn)樣、電泳、染色和脫色后，以Marker為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)出非洲爪蟾皮膚分泌物抗菌肽的相對(duì)分子量。

（2）結(jié)果。根據(jù)lgMW=K-bx(x為遷移率)可得出非洲爪蟾皮膚分泌物中活性蛋白分子量在20～90KD及小于20KD的小分子多肽。

5 討論

研究發(fā)現(xiàn)，兩棲類(lèi)動(dòng)物抵御外來(lái)微生物入侵是通過(guò)其皮膚分泌的抗菌肽來(lái)完成的[3]。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)兩棲類(lèi)動(dòng)物皮膚分泌物提取方法的比較以及抑菌活性的觀察，對(duì)非洲爪蟾皮膚分泌物分子量的測(cè)定，得出乙醚方法提取分泌物適用于皮膚薄、皮膚腺較為發(fā)達(dá)的兩棲類(lèi)動(dòng)物，而且得到分泌物的量較腎上腺素方法的多。腎上腺素方法提取分泌物適用于耳后腺發(fā)達(dá)的兩棲類(lèi)動(dòng)物，由此發(fā)現(xiàn)不同的方法適用于不同的兩棲動(dòng)物物種。

在提取兩棲類(lèi)動(dòng)物的皮膚分泌物前，了解該物種的皮膚屬于哪種結(jié)構(gòu)及分泌方式，采取合適的采集方法[4]。非洲爪蟾和中國(guó)林蛙皮膚分泌物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及紅色毛廯菌都有抑菌效果，兩棲動(dòng)物皮膚分泌物對(duì)大部分試驗(yàn)菌株均具有不同程度的抑菌活性[5]。兩棲動(dòng)物皮膚分泌物中抗菌肽抑菌效果可能作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，細(xì)胞壁一旦被破壞就會(huì)引起細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化和細(xì)胞死亡?？赡茏饔糜诩?xì)菌細(xì)胞膜，抗菌肽穿過(guò)第一道屏障-細(xì)胞壁后接觸到細(xì)菌細(xì)胞膜，氨基酸殘基與磷脂雙分子在靜電作用下發(fā)生結(jié)合。非洲爪蟾皮膚分泌物活性蛋白分子量大小為20～90KD以及小于20KD的活性多肽，從而推斷出抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的活性物質(zhì)為抗菌肽。