張振穎 胡媛媛 陳凱麗 侯彬彬

(1.香港大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，深圳 518053；2.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，沈陽 110031；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，大連 116023)

孢子絲菌病可引起皮膚、皮下組織以及附近淋巴管的慢性感染，導(dǎo)致化膿、潰爛及滲出，偶可累及肌肉、骨骼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等臟器[1]。在我國，孢子絲菌病發(fā)病率是僅次于念珠菌病和曲霉病的深部真菌病。孢子絲菌具有雙相性：室溫 (25℃)為菌絲相，無致病性；37℃為酵母相，酵母相可在感染者體內(nèi)增殖，具有致病性[2]。因此，孢子絲菌由菌絲相轉(zhuǎn)化為酵母相對其致病性的形成是必需的[3]。在孢子絲菌酵母相形成過程中，不僅菌株形態(tài)和細胞壁的組成成分發(fā)生改變，其酵母相特異表達的毒力基因也被誘導(dǎo)表達。目前，在雙相型病原真菌中鑒定出來的毒力基因主要有BAD1[4]、AGS1[5]、BYS1[6]和CBP1[7]等基因。與之比較，有關(guān)孢子絲菌酵母相形成過程的研究相對滯后，被鑒定出來的酵母相特異表達毒力基因數(shù)量很少，無法全面分析其雙相轉(zhuǎn)化的全過程。

MAPK通路在多種真菌中具有重要調(diào)控功能，釀酒酵母中MAPK級聯(lián)反應(yīng)至少參與五種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：細胞壁的完整性通路、孢子壁的組裝通路、菌絲的生長通路、信息素的反應(yīng)通路、高滲透性甘油通路, 從而調(diào)控其生長、形態(tài)改變、繁殖和應(yīng)激反應(yīng)[7-8]。

Ste-20激酶被鑒定為MAPK信號通路的上游調(diào)控激酶，目前其在真菌中的功能，主要集中在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中進行研究[9]。Ste-20通過依次激活MAPKKK-MAPKK-MAPK的級聯(lián)反應(yīng)來調(diào)控MAPK信號通路。Ste-20可以調(diào)控釀酒酵母的細胞壁形成、接合過程、滲透壓調(diào)節(jié)和菌絲生長等功能[10]。Ste-20在病原真菌中的作用報道較少，有報道其可以調(diào)控植物致病真菌玉米黑粉菌 (Ustilagomaydis)的接合過程和致病性[11]。另一Ste-20同源激酶PakA激酶 (p21-Activated Kinase)，被報道可以調(diào)控雙相型真菌馬爾尼非藍狀菌 (Penecillium，既往稱馬爾尼菲青霉Penecilliummarnefiii)的分生孢子萌發(fā)和酵母相細胞的形態(tài)[12-13]。

本實驗擬采用實驗室前期建立的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小分子雙鏈RNA干擾技術(shù)構(gòu)建Ste-20基因沉默[14]，觀察、分析Ste-20基因?qū)︽咦咏z菌在雙相轉(zhuǎn)換過程的影響，從而進一步分析Ste-20激酶在孢子絲菌中調(diào)控雙相轉(zhuǎn)換過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 觀察菌絲相形態(tài)

觀察接種于沙氏固體培養(yǎng)基平板上的菌株在25℃下的形態(tài)，研究Ste-20基因干擾后對株生長形態(tài)的影響。取標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10268和干擾株 (Ste-20i)于沙氏固體培養(yǎng)基平板上25℃培養(yǎng)，待生長3～7 d后觀察菌落形態(tài)。

1.2 觀察酵母相和菌絲相的生長情況

分別挑取標(biāo)準(zhǔn)株和干擾株，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),鏡檢觀察接種于兩種培養(yǎng)基中的菌株在25℃和37℃溫度下菌絲及孢子生長情況，研究Ste-20基因干擾對孢子絲菌菌絲相酵母相轉(zhuǎn)化的影響。

1.3 菌絲相的處理

將干擾株和標(biāo)準(zhǔn)株接種于沙氏培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中，25℃，150 r/min培養(yǎng)，每隔24 h取出200 mL待測培養(yǎng)液倒入離心管中，進行離心并用雙蒸水洗滌3次，在105℃烘箱中烘干，分別稱量不同菌株菌絲的干重。每一處理設(shè)置4次重復(fù)。

1.4 孢子生長情況的觀察

①將一定數(shù)量的野生標(biāo)準(zhǔn)株和干擾株的孢子絲菌菌液于BHI液基上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。②分別取相同OD值的野生標(biāo)準(zhǔn)株和干擾株菌液繼續(xù)于37℃ BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔24 h測定37℃ BHI培養(yǎng)基中菌株孢子OD值，觀察OD值變化。

1.5 透射電鏡觀察

進行取材，固定，漂洗，脫水 (30%乙醇或丙酮—50%乙醇或丙酮—70%乙醇或丙酮—90%乙醇或丙酮—100%乙醇或丙酮2次，每次每級10～30 min)，浸透，包埋，修塊，切片，染色，觀察。

2 結(jié) 果

2.1 Ste-20基因沉默后孢子絲菌的表型變化

菌落形態(tài)觀察 將孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株、干擾株分別在沙氏固體培養(yǎng)基平板上25℃培養(yǎng)3 d和7 d后，標(biāo)準(zhǔn)株和干擾株的菌落形態(tài)明顯變化，主要表現(xiàn)干擾株生長受到抑制，菌落直徑較標(biāo)準(zhǔn)株變小，色素生產(chǎn)減少 (見圖1)。

菌絲生長情況觀察 將相同OD值的標(biāo)準(zhǔn)株和干擾株在沙氏液體培養(yǎng)及中25℃培養(yǎng)24 h后，按前述方法稱種，標(biāo)準(zhǔn)株為0.299 7 g，干擾株為0.100 1 g；96 h后標(biāo)準(zhǔn)株為2.854 7 g，干擾株為0.812 7 g。即96 h后標(biāo)準(zhǔn)株增長了2.555 g，而干擾株只增長了0.712 6 g，提示干擾株菌絲生長緩慢 (見圖2)。

孢子生長情況觀察 相同OD值的標(biāo)準(zhǔn)株和干擾株菌懸液于37℃培養(yǎng)后，結(jié)果顯示在24 h后干擾株為0.17，標(biāo)準(zhǔn)株為0.47；96 h后干擾株為0.29，標(biāo)準(zhǔn)株為0.62；168 h (1周)后干擾株為0.52，標(biāo)準(zhǔn)株為1.01。提示下調(diào)Ste-20基因的表達對孢子的生長有抑制作用，孢子萌發(fā)緩慢 (見圖3)。

2.2 Ste-20基因干擾對孢子絲菌菌絲相酵母相轉(zhuǎn)化的影響

圖1比較Ste-20i干擾株，ATCC標(biāo)準(zhǔn)株在25℃生長時菌落的變化：A.Ste-20i干擾株25℃培養(yǎng)3 d；B.Ste-20i干擾株25℃培養(yǎng)7 d；C.ATCC標(biāo)準(zhǔn)株25℃培養(yǎng)3 d；D.ATCC標(biāo)準(zhǔn)株25℃培養(yǎng)7 d圖2不同時間下的申克孢子絲菌干重曲線圖

Fig.1Compared the colonies of Ste-20i and ATCC growing at 25℃:A. The Ste-20i cultured at 25℃ for 3 d; B. The Ste-20i cultured at 25℃ for 7 d; C. ATCC cultured at 25℃ for 3 d; D. ATCC cultured at 25℃ for 7 dFig.2Curve ofSporothrixschenckiidry weight at different times

Fig.3Curve of the OD value ofSporothrixschenckiiat different times

菌絲及孢子萌發(fā)的鏡檢觀察 相同數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)株和干擾株的孢子分別放在25℃和37℃的SDA和BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果顯示在25℃培養(yǎng)24 h后，干擾株菌絲生長延緩；37℃培養(yǎng)24 h后，標(biāo)準(zhǔn)株可見出芽產(chǎn)孢，干擾株的孢子萌發(fā)緩慢,菌絲變短，未見出芽產(chǎn)孢 (見圖4)。

2.3 Ste-20基因?qū)︽咦咏z菌超微結(jié)構(gòu)的影響

標(biāo)準(zhǔn)株和干擾株分別在SDA液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)25℃，7 d，使用透射電鏡觀察，由圖可見與標(biāo)準(zhǔn)株相比，干擾株細胞壁欠完整致密，變疏松，細胞質(zhì)也變得疏松、雜亂，菌絲較標(biāo)準(zhǔn)株變短，孢子也較標(biāo)準(zhǔn)株欠圓整 (見圖5)。

3 討 論

本課題組前期利用比較蛋白組學(xué)的方法，鑒定出Ste-20激酶為孢子絲菌酵母相特異表達蛋白[15]。隨后我們利用RACE方法從孢子絲菌中克隆了該基因，通過Real time RT-PCR方法進一步檢測，發(fā)現(xiàn)Ste-20的mRNA表達水平在酵母相是菌絲相15倍[16]。盡管已經(jīng)鑒定出很多Ste-20的功能，但對其在病原真菌，特別是雙相型病原真菌中的功能和調(diào)控機制知之甚少。根據(jù)細胞內(nèi)信號通路的網(wǎng)絡(luò)化作用方式，Ste-20激酶作為MAPK信號通路的上游調(diào)控蛋白，很可能與多種膜受體等多種上游信號關(guān)聯(lián)從而調(diào)控MAPK信號通路。結(jié)合文獻和我們的前期數(shù)據(jù)，推測Ste-20在孢子絲菌的雙相轉(zhuǎn)換和致病性形成中可能具有重要作用。其機制可能為Ste-20參與雙組份信號系統(tǒng)反應(yīng)調(diào)控蛋白SSK1激活MAPK通路的過程或者其存在Ste-20獨立的調(diào)控機制。我們采用實驗室前期建立的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小分子雙鏈RNA干擾技術(shù)構(gòu)建Ste-20基因沉默菌株，觀察、分析Ste-20基因下調(diào)對孢子絲菌在雙相轉(zhuǎn)換過程等方面的影響，初步確定了Ste-20激酶可能在調(diào)控孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換該過程中的作用,后期我們還將在致病性等方面繼續(xù)展開研究,這或許進一步闡明孢子絲菌病的發(fā)病機制，并發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點，提供新的治療策略。

圖4觀察分析Ste-20基因沉默對孢子絲菌孢子生成數(shù)量、孢子顯微形態(tài)等方面的影響：A.ATCC 25℃培養(yǎng)菌絲相;B.ATCC 37℃培養(yǎng)酵母相；C:Ste-20i 25℃培養(yǎng);D.Ste-20i 37℃培養(yǎng)圖5標(biāo)準(zhǔn)株與干擾株25℃培養(yǎng)透射電鏡結(jié)：A.標(biāo)準(zhǔn)株 (ATCC10268)25℃培養(yǎng)下的孢子；B.標(biāo)準(zhǔn)株 (ATCC10268)25℃培養(yǎng)下的菌絲；C.干擾株Ste-20i 25℃培養(yǎng)下的孢子；D.干擾株Ste-20i 25℃培養(yǎng)下的菌絲

Fig.4Observe and analyze the effects of Ste-20 gene silencing on sporulation quantity and spore morphology of sporidium spore: A. ATCC mycelium cultured at 25℃; B. ATCC yeast phase cultured at 37℃; C. Ste-20i culture at 25℃; D. Ste-20i cultured at 37℃Fig.5Transmission electron microscope result of standard strain and interferred strain at 25℃: A. Standard strain (ATCC10268) spores cultured at 25℃; B. Standard strain (ATCC10268) mycelium cultured at 25℃; C. Linterferred strain Ste-20i spores cultured at 25℃; D. Linterferred strain Ste-20i mycelium cultured at 25℃