李翔英 廉翠紅

(深圳大學第一附屬醫(yī)院 (深圳市第二人民醫(yī)院)皮膚科，深圳 518035)

淺部真菌病是皮膚病中的常見病和多發(fā)病，建立一種快速而準確的檢驗方法尤為重要。常用的真菌檢驗方法有直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、組織病理等。由于直接鏡檢方法簡便，可快速得出檢驗結果，是臨床最常用的檢驗方法之一。真菌直接鏡檢有多種浮載液可供選擇，其中KOH使用最為廣泛，其缺點是角質溶解慢，一般需要加熱，加熱不當易致氣泡產生，且成片背景雜亂，真菌結構不易分辨和判斷，易出現假陰性或漏診；熒光染色法是一種利用重組幾丁質酶來檢測標本中是否存在真菌有形成分的方法。真菌熒光染色液中，經過特殊熒光素標聯(lián)的重組幾丁質酶可以高親和力與真菌細胞壁上的幾丁質結合并發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下可以清楚的觀察到真菌形態(tài)。浮載液體用熒光染色液替代KOH溶液，鏡下菌絲形態(tài)結構清楚易辨，背景干凈、清晰，反差大，孢子染色后結構清晰，易于分辨，大大提高真菌陽性率，且顯著縮短真菌鏡檢時間。

1 對象與方法

1.1 病例選擇

選取2017年6月1日～8月31日于我科進行真菌直接鏡檢的患者，共獲得病例716例，其中熒光染色法548例，KOH濕片法168例，取材來源包括疑似體癬、股癬、花斑糠疹、手足癬等患者的皮損。

1.2 材料

10%KOH溶液 (實驗室自配)；真菌熒光染色液 (萊芙特敏真菌熒光染色液)。

1.3 操作步驟

①取材：75%酒精消毒患處后，用鈍刀刮取患處或用透明膠帶粘取患處皮屑；皮屑取皮損的活動性邊緣；水皰取皰壁和基底部皮損；膿皰取膿液，間擦性皮損去除浸漬表皮，刮取基底部損害；采集甲標本時刮取靠近病甲甲床的碎屑。②KOH濕片法：將皮屑置于玻片中央，滴1滴KOH后蓋上蓋玻片，并過火焰2～3次輕微加溫，輕壓蓋玻片吸出多余液體后，置于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡查找菌體，然后換高倍鏡觀察菌體結構，以查到菌絲或孢子為陽性結果。③熒光染色法：將皮屑置于玻片中央，滴1滴熒光染色液后蓋上蓋玻片，輕壓蓋玻片吸出多余染色液后，置于熒光顯微鏡下查找真菌菌絲或孢子。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SAS 9.1統(tǒng)計學軟件對檢查結果進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

本次實驗共納入病例716例，包括男性患者379例，女性患者343例，男女比例約為1.12∶1，包括手足癬、體股癬、花斑糠疹、甲癬等。熒光染色法共548例，陽性患者309例，陽性率為56.4%；KOH濕片法共168例，陽性患者50例，陽性率為29.8%。用SAS 9.1統(tǒng)計學軟件對兩組數據進行卡方檢驗，P<0.01，說明熒光染色組和KOH濕片法組差異有統(tǒng)計學意義，熒光染色法組陽性率明顯高于KOH濕片法組。

從表1可知，體股癬組、花斑糠疹組熒光染色法陽性率明顯高于KOH濕片法 (P<0.01)。但在手足癬組、甲癬組，雖然實驗組陽性率高于對照組，但經過統(tǒng)計學檢驗P>0.01，顯示兩組數據的差異無統(tǒng)計學意義，考慮原因為：①手足癬足及甲癬組樣本量較少，尤其是對照組樣本量少；實驗組與對照組樣本數量差異較大；②檢驗人員的經驗不足及操作不當；③臨床醫(yī)生診斷經驗不足。后續(xù)改進措施：①擴大樣本量；②設計嚴格的對照實驗，如自身對照，確定合理的實驗組及對照組樣本量；③對檢驗人員進行培訓及定期考核，規(guī)范操作流程。

表1熒光染色法與KOH濕片法陽性率的比較

Tab.1The comparison of positive rate in Fluorescent Staining and KOH Wet Method

熒光染色法KOH濕片法例數陽性陽性率例數陽性陽性率P值手足癬1012625.7%49816.3%0.196體股癬23715766.2%782532.1%0.0001花斑糠疹1228872.1%351645.7%0.0036甲癬883843.2%6116.7%0.395合計54830956.4%1685029.8%<0.01

3 討 論

本次研究中，圖1為1例股癬患者KOH濕片法的10×40倍鏡下觀，可以看到交織呈網狀的細長菌絲和散在孢子，但背景雜亂，菌體結構顯示不清，嚴重影響結果判讀。圖2～4分別為股癬、甲癬、花斑糠疹患者熒光染色法的鏡下觀，在熒光下，可以看到真菌菌絲及孢子含有幾丁質的細胞壁呈現熒光藍色，與背景對比明顯，可見菌絲橫隔，更易快速、準確地對檢測結果進行判讀，大幅提高檢驗的陽性率及檢驗效率。

淺部真菌病，尤其是皮膚癬菌病是皮膚科的常見病、多發(fā)病，真菌直接鏡檢是一種簡單、經濟、高效的真菌檢驗方法，能有效提高真菌病的診斷率，減少誤診。為了更快、更準確的為臨床提供診斷依據，真菌直接鏡檢的浮載液經過不斷的改良[1-8]，目前最常用于臨床的是KOH溶液、KOH可以軟化和溶解角蛋白、脂肪等組織碎屑，使真菌形態(tài)更清晰，但背景雜亂等問題一直無法得到較好的解決，導致KOH濕片法直接鏡檢有較高的陰性率和假陽性率，且嚴重依賴于檢驗人員的技術水平。熒光染色液中熒光標記的重組幾丁質酶可以特異性的與真菌細胞壁上的幾丁質結合，而角蛋白、脂質等成分不著色，使真菌菌絲和孢子與背景對比明顯，解決了KOH濕片法中背景雜亂的問題，大幅提高真菌鏡檢的陽性率，且不需要加熱加速角質溶解，具有操作簡便、快捷等優(yōu)點，值得臨床推廣。

圖1菌絲KOH濕片法鏡下觀 (10×40)圖2～4菌絲及孢子熒光染色法鏡下觀 (10×40)

Fig.1Hyphae in KOH Wet MethodFig.2-4Hyphaeand spores in Fluorescent Staining