王慶國(guó)，李臻，管延安，劉煒，潘教文

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生理生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100)

谷子[Setariaitalica(L.)Beauv.]又稱為粟，是起源于我國(guó)的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)作物，也是糧飼兼用作物。谷子去皮后俗稱小米，小米營(yíng)養(yǎng)豐富且各種成分均衡，具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，被我國(guó)列為“五谷”之首。谷子具有抗旱、耐瘠薄、生育期短、C4高光效、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，且細(xì)胞壁較厚、葉面積小、根系發(fā)達(dá)、水分利用效率較高，對(duì)干旱和鹽堿脅迫等都具有較好的耐受性。隨著谷子基因組測(cè)序計(jì)劃的完成及基因組序列的釋放，谷子逐漸發(fā)展成為研究禾本科作物新的模式作物[1,2]。

近年來結(jié)合高通量測(cè)序研究谷子的抗旱機(jī)制，并鑒定干旱響應(yīng)基因及非編碼RNA已有報(bào)道。Qi等[3]研究發(fā)現(xiàn)，PEG處理谷子后可導(dǎo)致2 824個(gè)基因及215個(gè) miRNA的表達(dá)發(fā)生變化。Yadav等[4]對(duì)兩個(gè)抗性不同的谷子品種測(cè)序，共鑒定到55個(gè)已知miRNA和136個(gè)新miRNA，其中18個(gè)已知和33個(gè)新miRNA均參與干旱脅迫響應(yīng)。Wang等[5]在干旱敏感品種An04中鑒定到81個(gè)已知的miRNA，其中有14個(gè)表達(dá)受干旱誘導(dǎo)，4個(gè)表達(dá)下調(diào)，同時(shí)也鑒定到72個(gè)新的miRNA，并結(jié)合降解組鑒定到82個(gè)miRNA的靶基因。最近，Tang等[6]對(duì)兩個(gè)抗性不同的谷子品種進(jìn)行了生理和轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫后抗性品種 “豫谷1號(hào)”通過抑制能量代謝來保護(hù)細(xì)胞，從而維持正常的植株生長(zhǎng)；而干旱敏感品種An04受脅迫后會(huì)消耗更多的能量，光合效率和細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。結(jié)合抗旱相關(guān)的QTL，作者進(jìn)一步鑒定到萌發(fā)期和苗期干旱抗性相關(guān)的20個(gè)候選基因。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，谷子在干旱脅迫后會(huì)產(chǎn)生大量的參與滲透保護(hù)和抗氧化的蛋白，參與能量代謝的蛋白也有較明顯的積累[7]。

隨著谷子基因組序列的釋放，谷子中脅迫相關(guān)的基因家族也逐漸被鑒定出來。如NAC、AP2/ERF、C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子、MYB、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子家族，及RNA聚合酶基因家族、PPR蛋白基因家族、DCPK基因家族、HSP基因家族等。谷子中各種脅迫及發(fā)育相關(guān)基因的功能也逐漸被研究及報(bào)道[8-14]。在水稻中異源表達(dá)自噬相關(guān)基因(autophagy-associated genes, ATG)SiATG8a能有效提高水稻對(duì)氮饑餓的耐受性[15]。在擬南芥中過表達(dá)SiCDPK24可顯著增強(qiáng)對(duì)干旱脅迫的抗性。SiNAC1通過促進(jìn)ABA的合成加速了葉片的衰老[13]。在K+缺乏和鹽脅迫下，SiHAK1作為K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白維持胞內(nèi)K+的穩(wěn)態(tài)。過表達(dá)LEA蛋白SiLEA14顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥和谷子的非生物脅迫抗性[16]。SiAGO1(argonaute1)對(duì)谷子正常的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)是必需的，該基因缺失導(dǎo)致多重發(fā)育缺陷，如植株矮小、葉片狹窄卷曲、小穗以及結(jié)實(shí)率低[17]。SiLP1編碼一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，該基因參與調(diào)控穗的發(fā)育、莖的伸長(zhǎng)及種子的大小[11]。

鑒于谷子抗旱機(jī)制的研究還不夠深入，本研究利用RNA-seq 技術(shù)對(duì)干旱脅迫處理不同時(shí)間的谷子進(jìn)行了測(cè)序分析，篩選干旱脅迫響應(yīng)基因，系統(tǒng)分析谷子的抗旱響應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步克隆抗旱相關(guān)基因提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 谷子種植與干旱處理

精選“豫谷1號(hào)”種子播種于花盆中，每個(gè)花盆中裝有3 kg營(yíng)養(yǎng)土和沙子的混合物(比例為1∶1),在溫室中正常生長(zhǎng)2周左右，光周期為14 h，晝夜溫度為30℃/25℃。用20%的PEG模擬干旱進(jìn)行短期處理，將花盆中的谷子幼苗取出，用清水將根部土壤洗凈，置于Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中適應(yīng)幾個(gè)小時(shí)，然后用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配置20%的PEG溶液處理6 h。長(zhǎng)期處理直接在花盆中處理，當(dāng)花盆中的土壤含水量低于30%后持續(xù)處理一周的時(shí)間，使含水量控制在20%～30%。處理完的材料經(jīng)液氮迅速冷凍，保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.2 利用RNA-seq技術(shù)篩選參與谷子干旱響應(yīng)的基因

與北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行合作，進(jìn)行了RNA-seq相關(guān)試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析，結(jié)合GO注釋(包括細(xì)胞組成、分子功能、生物過程)及KEGG代謝通路注釋，對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行分析及歸類。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)間處理后差異基因分析

在 RNA-seq 技術(shù)中，F(xiàn)PKM (expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced) 是每百萬測(cè)序堿基中來自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的fragments數(shù)目，其同時(shí)考慮了測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度對(duì)fragments計(jì)數(shù)的影響，是目前最為常用的基因表達(dá)水平估算方法。利用log2FoldChange: log2(樣品1的FPKM值/樣品2的FPKM值)代表差異基因的變化倍數(shù)。以log2FoldChange值大于2定義為表達(dá)上調(diào)的基因，以該值小于-2為表達(dá)下調(diào)的基因。如圖1A所示，與對(duì)照相比，谷子處理6 h后上調(diào)的基因有430個(gè)，下調(diào)的基因有183個(gè)。處理6 d后，與對(duì)照相比，上調(diào)的基因有606個(gè)，下調(diào)的基因有1 038個(gè)(圖1B)。谷子處理6 d后與處理6 h相比，上調(diào)的基因有206個(gè)，下調(diào)的基因有611個(gè)(圖1C)。

A：谷子處理6 h后的差異基因分布；B：谷子處理6 d后的差異基因分布；C：谷子處理6 d后與處理6 h相比的差異基因分布；篩選閾值默認(rèn)設(shè)置為Q-value < 0.05。

對(duì)這三組差異的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行共有與特有的差異轉(zhuǎn)錄本分析發(fā)現(xiàn)，有45個(gè)基因在這三組數(shù)據(jù)中共同存在，有177個(gè)差異基因在處理6 h后的谷子中被特異調(diào)控，有834個(gè)差異基因特異存在于處理6 d后的谷子中，有222個(gè)差異基因特異存在于處理6 d和6 h谷子的差異基因中(圖2)。

圖2 各差異轉(zhuǎn)錄本比較組合之間共有與特有數(shù)目的維恩圖

2.2 差異基因GO (Gene Ontology)富集分析

根據(jù)篩選到的差異基因，研究特異基因在 Gene Ontology 中的分布狀況將有助于闡明試驗(yàn)中樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。在GO富集分析中，主要分為三大類biological process (BP)、cellular component (CC)和molecular function (MF)(圖3)。

谷子處理6 h后的差異基因聚類分析發(fā)現(xiàn)，在biological process中，差異基因主要富集在biological_process和metabolic process中；在cellular component (CC)中，差異基因主要富集在extracellular region中；在molecular function (MF)中，差異基因主要富集在catalytic activity、metal ion binding和cation binding(圖3A)。在干旱處理6 d后的差異基因中，在biological process中，差異基因主要富集在biological_process和metabolic process中；在cellular component (CC)中，差異基因主要富集在membrane、intrinsic to menbrane和integral to membrane；在molecular function (MF)中，差異基因主要富集在catalytic activity和oxidoreductase activity中(圖3B)。在谷子處理6 d和6 h后的差異基因中，在biological process中，差異基因主要富集在metabolic process和biological_process中；在cellular component (CC)中，差異基因主要富集在extracellular region中；在molecular function (MF)中，差異基因主要富集在catalytic activity中(圖3C)。

A：處理6 h；B：處理6 d；C：處理6 d和6 h。

2.3 差異基因KEGG代謝途徑分析

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，通過KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes) Pathway 顯著性富集能確定特異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。通過對(duì)差異基因的KEGG途徑分析發(fā)現(xiàn)，谷子處理6 h后的差異基因主要富集在Phenylalanine metabolism、Phenylpropanoid biosynthesis、Protein processing in endoplasmic reticulum和Biosynthesis of secondary metabolites途徑中(圖4A)。而處理6 d后、處理6 d和6 h的差異基因主要富集在Phenylalanine metabolism、Phenylpropanoid biosynthesis、Metabolic pathway和Biosynthesis of secondary metabolites途徑中(圖4B和圖4C)。

A：處理6 h；B：處理6 d；C：處理6 d和6 h?？v軸表示Pathway名稱，橫軸表示Rich factor (候選基因集所占背景基因的比例)，點(diǎn)的大小表示此Pathway中差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)多少。

3 討論與結(jié)論

干旱會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞脫水及滲透脅迫，嚴(yán)重影響植物體內(nèi)各種正常的生理及代謝過程。脅迫信號(hào)會(huì)被細(xì)胞表面的受體所感知，并啟動(dòng)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18-20]。在本研究中，谷子干旱脅迫不同時(shí)間后，我們鑒定到各種不同的類受體蛋白激酶(如Si030010m、Si029783m、Si000257m)的表達(dá)明顯上調(diào)。干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度增加，鈣信號(hào)被相關(guān)的Ca2+結(jié)合蛋白(如Si002992m、Si024895m、Si002992m)感知后啟動(dòng)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。脅迫信號(hào)通過激活一些蛋白激酶或者磷酸酶進(jìn)一步向下傳遞[18]。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級(jí)聯(lián)途徑是真核生物中普遍存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式，滲透脅迫能夠激活MPK3、MPK6和MPK4，干旱脅迫能夠激活A(yù)tMEKK1-MKK1-MPK4級(jí)聯(lián)途徑[21,22]。在谷子中我們同樣鑒定到一個(gè)MAPKKK(Si025330m)基因被明顯誘導(dǎo)激活。對(duì)于特定刺激的細(xì)胞響應(yīng)主要依賴于MAPK激活的響應(yīng)幅度和持續(xù)時(shí)間，因此這個(gè)過程受到精細(xì)的調(diào)控。蛋白磷酸酶是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重要的負(fù)調(diào)控因子。PP2C型的磷酸酶AP2C1能夠滅活MPK4和MPK6[23]。在谷子干旱脅迫后有10個(gè)PP2C型蛋白磷酸酶的表達(dá)被激活，從而精細(xì)調(diào)控干旱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

激活后的MAPK通過磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而調(diào)控脅迫基因的表達(dá)。脅迫激活的MPK3/MPK6/MPK4能夠磷酸化WRKY和MYB轉(zhuǎn)錄因子[21]。最近的報(bào)道也發(fā)現(xiàn)，類受體蛋白激酶GUDK(GROWTH UNDER DROUGHT KINASE)磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子OsAP37介導(dǎo)干旱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活后的OsAP37進(jìn)一步誘導(dǎo)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來增強(qiáng)抗旱性和水稻產(chǎn)量[24]。本研究谷子在干旱脅迫后，多種轉(zhuǎn)錄因子(如DREB、NAC、WRKY、MYB、bHLH等)的表達(dá)被明顯誘導(dǎo)，這些結(jié)果與近兩年來谷子中轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定的結(jié)果基本一致。激活后的轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合脅迫響應(yīng)基因啟動(dòng)子中的順式調(diào)控元件，如DRE/CRT、ABRE、YCRS/MYBRS，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)[18]。下游脅迫響應(yīng)的功能蛋白，如LEA(late embryogenesis abundant protein)、不同分子量的HSPs(heat shock protein)、脫水素蛋白dehydrin、分子伴侶蛋白ClpB1(chaperone protein)等在干旱處理6 h和6 d后被明顯誘導(dǎo)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，水孔蛋白(aquaporin)在干旱脅迫6 d后明顯下調(diào)，水孔蛋白的下調(diào)可能有助于保持植物體內(nèi)的水分，防止水分的散失。泛素蛋白酶體途徑是真核生物體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解途徑，E3泛素連接酶在該過程中能特異性識(shí)別并結(jié)合底物蛋白，從而調(diào)節(jié)靶蛋白的降解代謝。研究表明E3泛素連接酶在植物脅迫響應(yīng)過程中起著重要的調(diào)控作用。擬南芥中的E3泛素連接酶DRIP1和DRIP2通過結(jié)合并泛素化DREB2A抑制其調(diào)控的干旱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)[25]。在本研究谷子脅迫響應(yīng)的后期(干旱處理6 d后)，發(fā)現(xiàn)10個(gè)E3泛素連接酶基因的表達(dá)受到明顯調(diào)控，說明E3泛素連接酶介導(dǎo)的泛素化途徑在谷子脅迫響應(yīng)過程中起著重要的調(diào)控作用。

本研究對(duì)干旱脅迫下的谷子進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，比較了不同時(shí)間處理后的差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步篩選并克隆谷子關(guān)鍵抗旱基因提供了依據(jù)，也為揭示谷子的抗旱機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。