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1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 53001；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530022

白飯樹來源于大戟科植物Flueggea virosa(Roxb.ex Willd.)Voigt.的干燥全株，為壯族民間常用藥材[1-3]，多以全株入藥，認(rèn)為其苦、微澀，涼，有小毒，具有清熱毒、除濕毒之功，用于能唅能累(濕疹)，頭瘡，唄膿顯(膿包瘡)，唄膿(癰腫)，發(fā)旺(痹病)。白飯樹在廣西分布于全區(qū)各地。文獻(xiàn)記載，從白飯樹的樹葉及嫩枝中分離出巖白菜素、右旋一葉萩堿 、山柰酚、槲皮素、沒食子酸、胡蘿卜苷和β-谷甾醇等[4-5]。其中，巖白菜素具有良好的鎮(zhèn)咳和治療胃腸道疾病如胃潰瘍、腹瀉及便秘的作用以及良好的抗炎、抗心律失常、抗病毒、護(hù)肝作用，是本品活性成分之一[6-9]。實(shí)驗(yàn)以巖白菜素為指標(biāo)成分，建立高效液相色譜法測定白飯樹藥材中巖白菜素含量，用于白飯樹藥材的質(zhì)量控制，為《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第三卷)》收錄白飯樹藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀(帶自動(dòng)進(jìn)樣器及VWD檢測器，安捷倫公司)；LC-20AT高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器，島津公司)；UV-2401PC紫外-可見分光光度計(jì)(島津公司)；KQ-3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)；XS205十萬分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；EASYPURE Ⅱ超純水器(美國熱電公司)。

1.2 材料 巖白菜素對照品(批號：111532-201203，純度94.4%，中國食品藥品檢定研究院供)。甲醇、乙腈為色譜純(德國merck公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。白飯樹藥材采自廣西15個(gè)不同產(chǎn)地，來源信息見表1。其中，BFS-1和BFS-8藥材采集了對應(yīng)帶果臘葉標(biāo)本，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員和廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定，均為大戟科植物白飯樹Flueggea virosa(Roxb.ex Willd.)Voigt。

表1 白飯樹樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為依利特SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(15∶85)，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長275 nm。

2.2 供試品溶液制備方法的篩選

2.2.1 提取方法的考察 取BFS-2粉末，分別比較超聲和加熱回流兩種提取方法制備的供試液巖白菜素含量。方法為取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，各精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量后，超聲處理30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；方法與上述類似，但超聲處理改為水浴加熱回流。分別精密吸取上述供試品溶液和對照品溶液5 mL進(jìn)樣測定巖白菜素含量。結(jié)果，上述兩種提取方法制備的供試品溶液巖白菜素含量相同(均為0.68%)。從操作簡便考慮，選擇超聲提取的方法。

2.2.2 供試品溶液制備方法的條件優(yōu)化 采用正交設(shè)計(jì)方法，對超聲提取的藥材破碎度、甲醇濃度、提取時(shí)間等三因素三水平進(jìn)行考察，見表2。以巖白菜素的含量為考核指標(biāo)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)，結(jié)果見3和表4。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交試驗(yàn)與結(jié)果

表4 方差分析

注:F0.05(2，2)=19，F(xiàn)0.01(2，2)=99

由表2和表3可知，影響巖白菜素得率的因素大小順序?yàn)椋核幉钠扑槎?甲醇濃度>提取時(shí)間，藥材破碎度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響有一般顯著性差異，其余因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響無顯著性差異。綜合考慮，確定最佳提取條件為A3B1C1。

2.3 對照品、供試品和陰性溶液制備 取巖白菜素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為60 μg/mL的溶液，作為對照品溶液；取本品粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞,稱定重量, 超聲處理(功率150 W，頻率40 KHZ)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。以甲醇溶液作為陰性對照溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取上述三種溶液各5 mL，照2.1項(xiàng)條件進(jìn)樣測定。結(jié)果：供試品溶液的色譜圖中均有與巖白菜素保留時(shí)間相同的吸收峰，陰性溶液的色譜圖則無此吸收峰。說明用本方法測定巖白菜素含量無陰性干擾，專屬性強(qiáng)。見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取巖白菜素對照品16.1 mg(純度為94.4%)，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。分別精密吸取以上對照品溶液0.15、1、2、3、4、5 mL分別置于5 mL量瓶中，各加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品稀釋溶液各5 mL，照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：巖白菜素進(jìn)樣量在0.045 6-1.519 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=1543.1X-8.003 7(r=0.999 9)。

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 重復(fù)性 取同一份供試品溶液(BFS-2)，照2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次。結(jié)果：6次測定巖白菜素峰面積分別為910.1、902.1、903.1、897.5、899.4、894.6，平均值為901.1，RSD=0.60%(n=6)。

2.6.2 重現(xiàn)性 取白飯樹藥材(BFS-2)粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，照2.3.1項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果：6份供試品溶液測得巖白菜素含量分別為0.68%、0.68%、0.68%、0.70%、0.70%、0.69%，平均值為0.69%，RSD=2.04%(n=6)。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取白飯樹藥材同一供試品溶液(BFS-2)，分別于0、2、4、6、12和24 h各進(jìn)樣測定。結(jié)果：24 h內(nèi)6次測得的巖白菜素含量分別為0.66%、0.67%、0.68%、0.67%、0.67%、0.67%，平均值為0.67%，RSD為1.19%(n=6)。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的樣品粉末(BFS-2)0.25 g共6份，精密稱定，各加入巖白菜素對照品的甲醇溶液(72.8 μg/mL)25 mL，照2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，并照2.1項(xiàng)色譜條件測定巖白菜素含量，計(jì)算平均回收率及RSD。結(jié)果：巖白菜素含量平均回收率為102.6%，RSD=2.09% (n=6)。見表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 儀器最低檢出限 取巖白菜素對照品甲醇溶液進(jìn)行稀釋，計(jì)算信噪比S/N=3及信噪比S/N=10時(shí)注入儀器的量。結(jié)果：巖白菜素對照品的最低檢出限為0.9 ng，最低定量限度為2.28 ng。

2.10 耐用性試驗(yàn) 分別采用依利特SinoChrom ODS-BP、Aglient 5 TC C18柱和Phenomenex Gmini C18(規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，5 μm)3根不同品牌色譜柱，測定樣品(BFS-2)中巖白菜素的含量。結(jié)果：3根色譜柱測定巖白菜素平均值為0.60%，RSD=1.73%(n=3)；分別采用安捷倫1260型和島津LC-20AT 2臺(tái)不同品牌的色譜儀，測定樣品(BFS-2)中巖白菜素含量。結(jié)果：2臺(tái)色譜儀測定巖白菜素平均值為0.61%，RAD=0.91% (n=2)。表明不同品牌色譜柱和不同品牌高效液相色譜儀對本法測定結(jié)果影響不大。

2.11 樣品測定 取上述1.2項(xiàng)巖白菜素對照品和15批藥材樣品，照2.2項(xiàng)方法制備對照品溶液和供試品溶液，照2.1項(xiàng)色譜條件測定，按藥材干燥品計(jì)算含量。結(jié)果：15批樣品巖白菜素含量為0.096%～1.43%。結(jié)果見表6。

表6 15批白飯樹中巖白菜素含量測定結(jié)果 (n=2)

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 在其它色譜條件相同的情況下，分別采用依利特SinoChrom ODS-BP、Aglien 5 TC C18和Phenomenex Gemini C18(規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，5 μm)三根色譜柱測定樣品(1號)。結(jié)果上述三根色譜柱均可得到良好的分離效果。本文選擇依利特SinoChrom ODS-BP作為色譜柱。

3.2 流動(dòng)相的選擇 在其它色譜條件相同的情況下，對甲醇-水(15∶85)、甲醇-水(18∶82)以及乙腈-水(15∶85)三個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，以及0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min三個(gè)流速進(jìn)行考察，結(jié)果：甲醇-水(15∶85)的流動(dòng)相系統(tǒng)分離效果較好，三種流速巖白菜素均可得到良好的分離效果，本文選用1.0 mL/min的流速。

3.3 波長選擇 采用島津UV-2401PC紫外-可見分光光度計(jì)對巖白菜素色譜峰在200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。巖白菜素在210 nm、275 nm波長有較大吸收，因?qū)嶒?yàn)過程中流動(dòng)相的甲醇在220 nm波長時(shí)有干擾，故確定檢測波長為275 nm。

3.4 實(shí)驗(yàn)過程中，比較過甲醇和乙醇兩種不同溶劑提取白飯樹中巖白菜素得率，結(jié)果用乙醇提取的樣品注入色譜儀測定后，色譜分離效果不佳，故最終采用甲醇提取法。

綜上，本法測定白飯樹中巖白菜素的含量，樣品提取方式簡單，且無其他成分干擾；方法學(xué)研究表明，該測定方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，分離度好，為白飯樹藥材的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。目前，本含量測定方法已收入《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第三卷)》“白飯樹”項(xiàng)下，作為該藥材生產(chǎn)、流通、使用和檢驗(yàn)的依據(jù)。