若存

1.湖南國華制藥有限公司，湖南 長沙 410013；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013；3.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102

玄麥利咽口服液系由玄參、麥冬、射干、桔梗、訶子等多味藥材研制而成的中藥6類新藥，具有滋陰清熱、散結(jié)利咽功效，用于熱盛津傷，熱毒內(nèi)盛所致的口干、咽痛、咽部有異物，分泌物不易咳出，干燥感、刺激感及失音等癥。為了有效地控制其內(nèi)在質(zhì)量，對方中的主要藥材玄參、桔梗、訶子分別進行了TLC薄層鑒別，對射干中的次野鳶尾黃素采用高效液相色譜法進行了含量測定[1]。本文建立的TLC薄層鑒別方法與HPLC測定含量的方法為玄麥利咽口服液的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(LabSolution色譜數(shù)據(jù)處理軟件，日本島津)；AL204電子分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司)。

1.2 材料 玄參(批號：121008-201308)、桔梗(批號：121028-201612)、訶子對照藥材(批號：121015-201605)、次野鳶尾黃素對照品(批號：111557-200602)均由中國食品藥品檢定研究院提供；玄麥利咽口服液由課題組提供，批號分別為：20170311、20170405、20170410、20170415、20171012、20171022、20171102。甲醇、磷酸均為色譜純，其它試劑均為分析純。2TLC鑒別[1]

2.1 玄參的TLC鑒別 分別取三個批號(20170405、20170410、20170415)的玄麥利咽口服液10 mL，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.2 cm，柱高20 cm)，用水洗脫至流出液無色，再用乙醇洗脫，收集洗脫液25 mL，蒸干，殘渣加適量甲醇溶解，溶液加到中性氧化鋁柱(100～200目，內(nèi)徑為1.2 cm，1.2 g，濕法上柱)上，再用甲醇15 mL洗脫，洗脫液濃縮至1 mL，分別作為供試品溶液。另取玄參對照藥材1 g，加甲醇25 mL，浸泡1 h，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。按處方取除玄參外的藥材，照玄麥利咽口服液制備工藝制備缺玄參的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成缺玄參的陰性樣品溶液。照TLC法試驗，吸取上述5種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(12∶3.5∶1∶0.05)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點顯色清晰。供試品色譜圖中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，且缺玄參陰性樣品無干擾。見圖1。

2.2 桔梗的TLC鑒別 分別取三個批號(20170405、20170410、20170415)的玄麥利咽口服液10 mL，水浴蒸干，浸膏分別加75%甲醇25 mL，20%鹽酸2 mL，80 ℃加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，分別作為供試品溶液。取桔梗對照藥材2 g，自加75%甲醇25 mL起，按供試品同法制成對照藥材溶液。按處方取除桔梗外的藥材，照玄麥利咽口服液制備工藝制備成缺桔梗的陰性樣品，再按供試品方法制成缺桔梗陰性樣品溶液。照TLC法試驗，分別吸取上述5種液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙醚(2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜圖中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，缺桔梗陰性樣品無干擾。見圖2。

2.3 訶子的TLC鑒別 分別取三個批號(20170405、20170410、20170415)的玄麥利咽口服液6 mL，通過處理好的聚酰胺柱(30～60目，內(nèi)徑為1 cm，柱高為15 cm，用水濕法上柱)上，先用水洗至流出液無色，再用乙醇洗脫，收集洗脫液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，分別作為供試品溶液。另取訶子對照藥材2 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為對照藥材溶液。按處方取除訶子外的藥材，照玄麥利咽口服液制備工藝制備成缺訶子的陰性樣品，再按供試品方法制成缺訶子的陰性樣品溶液。照TLC法試驗，吸取上述5種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠 g薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(3∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在與訶子對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點，缺訶子陰性樣品無干擾。見圖3。

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗檢測 波長：266 nm；色譜柱：TECHI C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液(53∶47)；柱溫:室溫；進樣量：10 μL。流量：1.0 mL/min；在上述條件下測定，按次野鳶尾黃素峰計理論板數(shù)應(yīng)不低于4000。

3.2 對照品溶液的制備 取次野鳶尾黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含11.94 μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 精密吸取玄麥利咽口服液0.4 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性樣品的制備 按玄麥利咽口服液處方、工藝制備成缺射干陰性樣品，再“3.3”項下方法制成缺射干的陰性樣品溶液。

3.5 測定波長的確定 取次野鳶尾黃素對照品的甲醇溶液(C=11.94 μg· mL-1)，在紫外分光光度計200～700 nm波長間掃描。見圖4。

3.6 專屬性試驗 按“3.1”項下設(shè)定的色譜條件， 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各10 μL，注入液相相色譜儀，見圖5。

3.7 線性關(guān)系考察 精密吸取次野鳶尾黃素對照品溶液(C=11.94 μg·mL-1)1、5、10、15、20 μL進樣，測定其峰面積積分值，以進樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y=6E+06x，r=0.9999。結(jié)果表明次野鳶尾黃素在0.01194～0.2388 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.8 穩(wěn)定性考察 分別精密吸取供試品溶液于0、4、8、12、24 h進樣，每次進10 μL，以次野鳶尾黃素峰面積積分值計，RSD為3.19%，結(jié)果說明室溫條件下供試液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 精密度考察 精密吸取“3.3”項下供試品溶液，重復(fù)進樣6次，每次進10 μL，以次野鳶尾黃素峰面積積分值計，RSD為0.32%，表明儀器精密度良好。

3.10 重復(fù)性考察 取批號20170311樣品，6份，按“3.3”項下制備，測定，計算次野鳶尾黃素含量，以含量計，RSD為1.55%，結(jié)果說明方法重復(fù)性好。

3.11 中間精密度試驗 取批號20170311樣品，6份，按“3.3”項下制備(由不同人員操作)，用不同的液相色譜儀進行測定，計算次野鳶尾黃素含量，以含量計，RSD為1.52%，結(jié)果說明中間精密度良好。

3.12 樣品加樣回收率試驗 精密量取已知含量為0.236m g·mL-1的樣品(批號20170311)溶液0.2 mL，6份，分別精密加入次野鳶尾黃素對照品溶液(12.05 μg.mL-1)4 mL，即0.0482 mg，按上述供試品溶液制備方法制備，測定含量，計算回收率，平均值為102.52%，RSD為2.85%。，結(jié)果見表1。

3.13 含量測定 取6批中試產(chǎn)品， 按上述方法測定，結(jié)果見表2。

表1 回收率測定結(jié)果

表2 含量測定 (n=3)

4 討論

4.1 薄層鑒別 玄參為方中的君藥，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)的功能，主要含環(huán)烯醚萜和苯丙素2大類成分，包括珊瑚苷、毛蕊花糖苷、苯乙醇苷、哈巴苷、哈巴俄苷、麥角甾苷、安格咯苷C等。上述成分是玄參抗炎、抗血小板聚集及調(diào)節(jié)免疫功能的主要有效成分[2-4]，由于本品其他藥味含苷類成分多，鑒別時相互干擾，所以本試驗采用D101型大孔樹脂柱及氧化鋁柱純化供試品，去除了干擾成分，結(jié)果玄參特征斑點清晰，玄參陰性樣品無干擾。桔梗為方中臣藥，具有宣肺，利咽，祛痰，排膿的功能。主要成分為皂苷類，包括桔梗皂苷A、B、D，遠(yuǎn)志苷D、D2等成分，藥理研究表明上述成分有抗炎、抗氧化、止咳祛痰作用[5-6]。本試驗對供試品采用酸水解，三氯甲烷提取苷元的方法，結(jié)果桔梗特征斑點清晰，桔梗陰性樣品無干擾。訶子為方中臣藥，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽的功能。主要含酚酸類，沒食子酰葡萄糖類，其中以莽草酸、兒茶酸、沒食子酸和糅花酸的含量較高。藥理研究表明上述成分為抗病毒、抗炎、抗菌及抗氧化的有效成分[7-9]。本法依據(jù)訶子所含的酚性成分與聚酰胺形成氫鍵而與復(fù)方中干擾成分分離，結(jié)果訶子特征斑點清晰，訶子陰性樣品無干擾。

4.2 含量測定

4.2.1 含量指標(biāo)的選定 玄參與麥冬為方中君藥，實驗中曾對其主要成分進行了含量測定試驗，結(jié)果表明陰性有干擾。射干為方中臣藥，主要成分為黃酮類及三萜類化合物等，包括次野鳶尾黃素、野鳶尾黃素、德鳶尾素、鳶尾黃素、射干苷、野鳶尾苷、白射干素等約20個，其中次野鳶尾黃素為治療咽痛喉痹的主要有效成分之一[10-11]，《中國藥典》2015年版規(guī)定該成分為射干藥材含量測定指標(biāo)成分，因此選其作為本品質(zhì)量控制指標(biāo)。

4.2.2 樣品的制備 文獻(xiàn)報道復(fù)方制劑中對次野鳶尾黃素的純化有很多種方法[12]，本試驗比較了乙酸乙酯萃取法與本品直接取樣經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾法，結(jié)果前一種方法提取不完全，而后一種方法簡單，缺射干的陰性樣品無干擾，因此選擇了該法。

4.2.3 樣品的測定 使用所建立的方法對6批中試產(chǎn)品進行次野鳶尾黃素的含量測定，結(jié)果表明本法方法準(zhǔn)確、靈敏、簡便、快速、重復(fù)性好，可作為本產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。