李國(guó)衛(wèi)，索彩仙，吳文平，潘禮業(yè)，胡綺萍，何嘉瑩，孫冬梅

廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佛山 528244

2020年版《中國(guó)藥典》收載的訶子屬藥材品種有訶子、絨毛訶子、西青果。訶子性苦、酸、平，歸肺、大腸經(jīng)，為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.或絨毛訶子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的成熟果實(shí)，每年的秋、冬季果實(shí)成熟的時(shí)候采收；西青果別名藏青果，是使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥幼果[1]，每年的9～10月將尚未成熟的幼果采下，置于沸水中略煮燙，曬干或者是烘干。訶子、絨毛訶子及西青果化學(xué)成分較為相似，以可水解類鞣質(zhì)為主[2-4]，還含有多酚類、黃酮類等化學(xué)成分。訶子具有抗病毒、抗炎、降血糖和鎮(zhèn)咳等藥理作用[5,6]，西青果清熱生津，解毒，主治陰虛白喉，具有清除羥自由基、抗氧化等功效，臨床常用于咽喉腫痛、咽炎等癥狀[7]，兩者的藥理作用、性味功效存在較大不同[8]。

目前針對(duì)訶子屬的研究多以單個(gè)品種的含量測(cè)定及特征圖譜為主，但未見(jiàn)有對(duì)訶子屬藥材的整體質(zhì)量研究[9-14]。Zhao等[15]基于化學(xué)成分預(yù)測(cè)了訶子的Q-marker可能為沒(méi)食子酸、訶子酸、訶藜勒酸、鞣花酸，在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過(guò)建立多指標(biāo)含量測(cè)定方法，利用化學(xué)模式識(shí)別法，包括方差分析、聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，探討訶子、絨毛訶子和西青果三者的差異，以期為訶子屬藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)及資源利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters H-Class型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；XP-26型百萬(wàn)分之一天平，ME204E型萬(wàn)分之一天平(瑞士Mettler公司)；Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)：110831-201906，含量：91.5%)、柯里拉京對(duì)照品(批號(hào)：111623-200301，含量：≥98%)，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；訶子次酸對(duì)照品(批號(hào)：Yz0613211，含量：≥98%)由南京源植生物科技有限公司提供；安石榴苷(A&B)對(duì)照品(批號(hào)：CFS201901，含量：≥98%)、訶藜勒酸對(duì)照品(批號(hào)：CFS201901，含量：≥98%)、訶子酸對(duì)照品(批號(hào)：CFS201902，含量：≥98%)，由武漢天植生物技術(shù)有限公司提供；甲醇、乙腈為色譜純；水為純化水；其余試劑為分析純。

實(shí)驗(yàn)所用藥材共44批，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，H1～H17號(hào)樣品為使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥成熟果實(shí)；X1～X14號(hào)樣品為使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥幼果；RH1～RH13為使君子科植物絨毛訶子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實(shí)，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 藥材信息來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～3 min，0%A；3～5 min，0%→3%A；5～12 min，3%→10%A；12～20 min，10%A；20～25 min，10%→14%A；25～35 min，14%→17%A；35～40 min，17%→21%A；40～45 min，21%→60%A；45～50 min，60%A)，流速為0.35 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

2.2 對(duì)照品溶液制備

取訶子次酸、沒(méi)食子酸、安石榴苷(A&B)、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為413.560、105.271、519.400、116.700、1609.552、495.635 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性

取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液，供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，訶子次酸、沒(méi)食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在1.00～1.05之間?；旌蠈?duì)照品溶液及供試品溶液見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品、供試品UPLC圖Fig.1 UPLC chart of reference substance and sample注：A：混合對(duì)照品；B：訶子；C：西青果；D：絨毛訶子。1：訶子次酸；2：沒(méi)食子酸；3：安石榴苷A；4：安石榴苷B；5：柯里拉京；6：訶藜勒酸；7：訶子酸。Note:A:Mixed references;B:Mature fruit of T.chebula Retz.;C:Immature fruit of T.chebula Retz.;D:Mature fruit of T.chebula Retz.var.tomentella Kurt.1:Chebulic acid;2:Gallic acid:3:Punicalagin A;4:Punicalagin B;5:Corilagin;6:Chebulagic acid;7:Chebulinic acid.

2.4.2 線性范圍

取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋制得6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，其中訶子次酸質(zhì)量濃度分別為0.345、3.446、34.463、206.780、413.560、620.340 μg/mL，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度分別為0.351、3.509、35.090、105.271、210.542、315.812 μg/mL，安石榴苷A+B質(zhì)量濃度分別為2.841、28.410、259.700、519.400、831.040、1 038.800 μg/mL，訶藜勒酸質(zhì)量濃度分別為0.340、3.404、34.039、1 005.970、1 609.552、2 011.940 μg/mL，柯里拉京質(zhì)量濃度分別為0.389、3.890、38.900、116.700、233.400、350.100 μg/mL，訶子酸質(zhì)量濃度分別為0.346、3.459、34.594、495.635、793.016、991.270 μg/mL,以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，得到各個(gè)對(duì)照品的線性關(guān)系良好，R2值均值0.999 5以上，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.3 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，訶子酸、沒(méi)食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸的峰面積RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，訶子酸、沒(méi)食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸的峰面積RSD<2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品粉末約0.25 g，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，訶子酸、沒(méi)食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸的峰面積RSD<2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率考察

精密稱取已知含量的訶子藥材(H17)0.125 g，平行6份，加入與樣品中含量等量的對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。測(cè)得7個(gè)成分平均加樣回收率均在97.34%～99.75%，RSD<3%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 回歸方程及線性范圍

表3 加樣回收考察

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.4.7 結(jié)果與分析

2.4.7.1 含量測(cè)定結(jié)果

精密稱取44批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到含量測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，3種藥材的7個(gè)成分含量存在顯著差異，RSD在33.03%～77.32%之間。其中，RSD≥50%的包括6個(gè)成分，分別為沒(méi)食子酸(49.5%)、安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸；訶子次酸在不同批次樣品中較為穩(wěn)定，RSD為33.03%。

表4 含量測(cè)定結(jié)果

續(xù)表4 (Continued Tab.4)

2.4.7.2 方差分析

以上述7個(gè)含量測(cè)定指標(biāo)為檢驗(yàn)變量，訶子、西青果、絨毛訶子作為分組變量，采用SPSS 20.0軟件，通過(guò)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)法對(duì)44批藥材樣品7個(gè)成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布驗(yàn)證，結(jié)果顯示7個(gè)指標(biāo)的sig.值均小于0.05，不服從正態(tài)分布；因此采用非參數(shù)檢驗(yàn)法(秩和檢驗(yàn))進(jìn)行下一步分析，選擇Kruskal-Wallis法進(jìn)行對(duì)三個(gè)不同基原的7個(gè)指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果見(jiàn)表5。其中，安石榴苷A & B、訶藜勒酸在三組樣品間均有極顯著差異(P<0.01)；訶子次酸在訶子與西青果、西青果與絨毛訶子間有極顯著差異(P<0.01)，在訶子與絨毛訶子間無(wú)顯著差異；柯里拉京在訶子與絨毛訶子、西青果與絨毛訶子間有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，在訶子與西青果無(wú)顯著差異；沒(méi)食子酸在訶子與絨毛訶子、訶子與西青果間有極顯著差異(P<0.01)；在絨毛訶子與西青果間無(wú)顯著差異；訶子酸在西青果與絨毛訶子、訶子與絨毛訶子間有極顯著差異(P<0.01)，在訶子與西青果間無(wú)顯著差異；上述分析結(jié)果說(shuō)明訶子、西青果、絨毛訶子三者間的成分含量存在差異。

表5 各含量指標(biāo)分析表

2.4.7.3 聚類分類

運(yùn)用SPSS軟件對(duì)44批藥材樣品7個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以余弦距離作為樣品相似度的距離公式，樣品聚為3類(見(jiàn)圖2)。13批絨毛訶子樣品(RH1～RH13)聚為一類，14批訶子樣品(H1～H14)聚為一類，14批西青果樣品(X1～X14)與3批訶子(H15～H17)樣品聚為一類。從總體數(shù)據(jù)來(lái)看，不同品種藥材樣品間具有明顯差異，其中絨毛訶子與其他兩種藥材的差異較大，距離為25時(shí)就可以歸為不同的類型；西青果和訶子具有一定的相似性，當(dāng)距離為20時(shí)，可以聚為一類，當(dāng)距離為15時(shí)，兩者可以區(qū)分，但仍然有部分訶子樣品未能在西青果樣品中分離，在距離為5時(shí)才能完全分離，說(shuō)明兩者具有較高的相似性。

2.4.7.4 主成分分析

以7個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果為變量，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析，由表6可知，共提取了2個(gè)特征值大于1的主成分，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)86.674%，表明可以用2個(gè)主成分反映不同樣品主要的質(zhì)量特征。從表7可以看出，在第一主成分有較高載荷的包括安石榴苷A&B、柯里拉京、訶藜勒酸；在第二主成分有較高載荷的包括沒(méi)食子酸、訶子酸。(載荷值>0.80)以降維得到的2個(gè)主成分得分作為X、Y軸，得到44個(gè)樣品的散點(diǎn)分布圖，結(jié)果顯示，3種藥材樣品能實(shí)現(xiàn)較好區(qū)分，同類樣品基本能聚在同一區(qū)域，說(shuō)明3種藥材之間的成分存在一定差異，結(jié)果見(jiàn)圖4。三批訶子樣品(H15～H17)與西青果樣品聚在同一區(qū)域，與聚類分析結(jié)果一致。3種樣品的主成分得分分析：西青果樣品除X1的主成分2評(píng)分為-0.08外，2個(gè)主成分評(píng)分基本為正值；絨毛訶子樣品主成分1評(píng)分均為負(fù)值，主成分2評(píng)分除個(gè)別批次(RH1)外均為正值；訶子樣品除H15～H17外，其他樣品的兩個(gè)主成分評(píng)分基本為負(fù)值，結(jié)果見(jiàn)表8。

圖2 44批藥材樣品聚類分析結(jié)果Fig.2 Cluster analysis results of 44 batches of samples

2.4.7.5 OPLS-DA

依據(jù)PCA結(jié)果，對(duì)3種不同藥材樣品進(jìn)行OPLS-DA分析。該OPLS-DA模型，R2X(cum)=0.976，R2X(cum)=0.936，Q2(cum)=0.923，均大于0.5，說(shuō)明模型穩(wěn)定可靠，可用于使君子科不同藥材樣品的區(qū)分。結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)的分類算法中OPLS-DA的效果較好，可使3種樣本點(diǎn)完全被分開(kāi)，相互之間沒(méi)有樣品出現(xiàn)交叉的情況，且全部樣品均位于95%可信區(qū)間之內(nèi)，說(shuō)明3種樣品在這7種化學(xué)成分含量上存在一定的差異，結(jié)果見(jiàn)圖5。采用變量重要性投影值(ariable importance in project，VIP)篩選體現(xiàn)3種樣品差異性的標(biāo)志物，其中VIP值大于1的成分包括3個(gè)，分別為訶子酸(VIP=1.06)、安石榴苷A&B(VIP=1.01)，是體現(xiàn)3種樣品間差異的主要標(biāo)志性成分，其余峰VIP值小于1，對(duì)樣品的區(qū)分影響較小，結(jié)果見(jiàn)圖5。

表6 特征根、各主成分的貢獻(xiàn)率

表8 主成分得分

圖3 主成分得分分布圖Fig.3 Score plot of principal components

3 分析與討論

3.1 檢測(cè)條件的確定

安石榴苷A與安石榴苷B為一對(duì)同分異構(gòu)體，且容易發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，本研究已在色譜條件下將兩者分離，呈雙峰，但考慮到兩者容易發(fā)生相互轉(zhuǎn)化若單獨(dú)計(jì)算會(huì)影響加樣回收率的計(jì)算，故以2個(gè)色譜峰峰面積之和計(jì)算。在200～400 nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，訶子次酸、沒(méi)食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸在270 nm均有最大吸收，故選擇270 nm為同時(shí)測(cè)定波長(zhǎng)。

圖4 OPLS-DA得分圖Fig.4 Score plot of OPLS-DA注：橫坐標(biāo)t[1]為預(yù)測(cè)主成分值；縱坐標(biāo)t[2]為正交主成分值。Note:X-axis is predicted principal component value;Y-axis is orthogonal principal component value.

圖5 7個(gè)化學(xué)成分的VIP值Fig.5 VIP value of 7 chemical components

3.2 多指標(biāo)含量測(cè)定結(jié)果分析

本研究測(cè)定了2020年版《中國(guó)藥典》收載的3種訶子屬藥材訶子、絨毛訶子、西青果中7種化學(xué)成分的含量，并結(jié)合方差分析、聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法 - 判別分析等化學(xué)計(jì)量法分析了不同種藥材含量的差異。方差分析結(jié)果顯示，訶子次酸、安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸5個(gè)成分在西青果中含量均值均最高，且與其他兩種藥材的含量均值均有明顯差異，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；訶子酸在訶子中含量均值最高，且與其他兩種藥材的含量均值均有明顯差異(P<0.01)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；沒(méi)食子酸在絨毛訶子中含量最高，但與西青果的含量差異不大，但兩者與訶子的含量均值有明顯差異((P<0.01)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聚類分析、主成分分析與正交偏最小二乘法-判別分析均可以將不同樣品按品種進(jìn)行劃分，主成分分析結(jié)果顯示安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、沒(méi)食子酸、訶子酸為體現(xiàn)不同品種差異的主要因素，正交偏最小二乘法-判別分析結(jié)果顯示訶子酸、安石榴苷A&安石榴苷B為區(qū)分不同品種的主要因素。綜上可見(jiàn)，不同訶子屬藥材的化學(xué)成分組成較為接近，其差異主要體現(xiàn)在不同化學(xué)成分的含量上，安石榴苷A、安石榴苷B、訶子酸、柯里拉京、訶藜勒酸、沒(méi)食子酸等成分在不同訶子屬藥材間的差異較大，建議建立對(duì)訶子屬藥材的進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制，才能全面評(píng)價(jià)該類藥材的質(zhì)量。

在主成分分析結(jié)果中有三批訶子樣品(H15～H17)其得分分布與西青果靠近，分析含量測(cè)定數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，這三批樣品的含量數(shù)據(jù)均接近訶子、西青果整體含量均值的中間值，而訶子為使君子科植物訶子干燥成熟果實(shí)，而西青果則為使君子科植物訶子的干燥幼果，推測(cè)可能是由于果實(shí)成熟度不足導(dǎo)致。從本研究中的結(jié)果可以看出，除訶子酸外，訶子的其余6個(gè)指標(biāo)均遠(yuǎn)低于西青果，訶子酸則大幅度高于西青果，說(shuō)明訶子在成熟的過(guò)程中，其含量組成會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，也從另一方面為訶子與西青果藥效特點(diǎn)不一致提供了依據(jù)。

本研究建立了訶子屬藥材7個(gè)指標(biāo)成分的UPLC含量測(cè)定方法，對(duì)44個(gè)不同藥材樣本進(jìn)行了測(cè)定，并采用方差分析、聚類分析、主成分分析與正交偏最小二乘法-判別分析對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了分析，分析結(jié)果顯示3種訶子屬藥材的成分組成存在明顯差異，為訶子屬藥材的質(zhì)量控制提供了可靠的分析方法與參考依據(jù)。