程茂軍，郭 杰，劉 婧，謝賽賽,3*

1江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；2江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；3江西本草天工科技有限責(zé)任公司，南昌 330004

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指機(jī)體在受到刺激時(shí)，活性氧(reactive oxygen species， ROS)或活性氮(reactive nitrogen species，RNS)自由基的含量超過其自身可清除的范圍，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡失調(diào)，系統(tǒng)和組織損傷，最終引起一系列疾病的產(chǎn)生。為應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，機(jī)體自我表達(dá)產(chǎn)生了一系列內(nèi)源性抗氧化因子，包括抗氧化分子和解毒酶，其中，Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路在介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性抗氧化因子過程中起到了至關(guān)重要的作用[1]。研究表明，在包括肝，肺，胃腸道，腦，皮膚，以及膀胱在內(nèi)的多種組織器官中，Nrf2蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞保護(hù)基因呈現(xiàn)出較低的基礎(chǔ)與誘導(dǎo)表達(dá)水平。此外，Nrf2蛋白在癌癥、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫疾病、糖尿病等疾病中發(fā)揮重要作用[2]，因此，尋找高效的Nrf2激活劑已成為治療氧化應(yīng)激參與類疾病的重要策略。

天然產(chǎn)物對(duì)于藥物發(fā)現(xiàn)具有重要意義，許多藥物都直接或間接來源于天然產(chǎn)物[3]。目前，已知的絕大多數(shù)Nrf2激活劑是天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的衍生物。本文闡述了Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路的結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制，并綜述了近期國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中報(bào)道的含有Nrf2激活活性的天然產(chǎn)物及其衍生物，以期為更深入的研究提供參考。

1 Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路

細(xì)胞內(nèi)存在多種抵御氧化應(yīng)激的抗氧化因子，包括維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)性和結(jié)構(gòu)性蛋白以及Ⅱ相解毒酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、還原型谷胱甘肽(GSH)、NAD(P)H醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素加氧酶-1(HO-1)等[4-9]。當(dāng)機(jī)體的ROS或RNS水平過高時(shí)，細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)這些抗氧化因子的表達(dá)，抵御氧化應(yīng)激，編碼這些抗氧化因子的基因含有共同啟動(dòng)子元件，稱為抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)，亦稱親電體反應(yīng)元件[10](electrophile response element，EpRE)。

ARE是由Daniel實(shí)驗(yàn)室在研究編碼谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶Ya啟動(dòng)子時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種含有特異性DNA序列的順式調(diào)控元件，位于編碼解毒酶及細(xì)胞保護(hù)蛋白基因的上游[11]。通常，ARE誘導(dǎo)下游抗氧化因子的表達(dá)是通過激活轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)來調(diào)控的。Nrf2由Moi等[12]發(fā)現(xiàn)并命名，屬于Cap‘n’Collar堿性亮氨酸拉鏈家族的一員，大量存在于中樞和外周組織器官中。調(diào)控Nrf2活性的主要因子為Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)[13]。Keap1通過Nrf2上的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(DLG和ETCE)與Nrf2產(chǎn)生相互作用，再通過與Cullin3(Cul3)依賴的E3泛素連接酶復(fù)合物銜接，促進(jìn)Nrf2發(fā)生泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體降解，進(jìn)而抑制Nrf2活性。

研究發(fā)現(xiàn)，一分子Nrf2能夠同兩分子Keap1結(jié)合，DLG和ETCE是連接Nrf2與Keap1的關(guān)鍵序列。正常情況下，Keap1蛋白與ETGE和DLG都產(chǎn)生相互作用，通過與Cullin3(Cul3)依賴的E3泛素連接酶復(fù)合物的底物銜接，導(dǎo)致Nrf2泛素化并被蛋白酶體降解，抑制Nrf2的活性。在氧化應(yīng)激條件下，ROS、RNS、親電試劑等能夠共價(jià)修飾Keap1的半胱氨酸殘基(如Cys151、Cys257、Cys273、Cys288和Cys297)，導(dǎo)致Keap1構(gòu)象發(fā)生變化，Nrf2從具有較低親和力的DLG上釋放下來，而Nrf2本身仍通過高親和力的ETGE與Keap1相連(Nrf2與Keap1結(jié)合的此類結(jié)構(gòu)模型被稱為“門閂-鉸鏈模型[14]”)，從而阻止了Nrf2的泛素化，致使Nrf2與Keap1結(jié)合處于飽和狀態(tài)，新合成的Nrf2易位至細(xì)胞核，與小分子肌腱纖維瘤蛋白(maf)結(jié)合成異二聚體并識(shí)別結(jié)合ARE，啟動(dòng)下游抗氧化因子的表達(dá)，提高細(xì)胞的抗氧化能力(圖1)[15]。

圖1 Keap1-Nrf2-ARE 信號(hào)通路Fig.1 Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway注：D為DLG基序，E為ETGE基序。正常情況下，Keap1與胞漿內(nèi)的Nrf2相互作用，致使Nrf2泛素化，使Nrf2維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平；在氧化應(yīng)激條件下，Keap1的半胱氨酸殘基被共價(jià)修飾，致使Keap1構(gòu)象變化導(dǎo)致Nrf2釋放并易位至細(xì)胞核以調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)。Note:D is DLG motif,E is ETGE motif.Under normal physiological conditions,Nrf2 interacts with Keap1,followed by Nrf2 ubiquitination,maintaining Nrf2 at a relatively low level.Under oxidative stress,cysteine residues of Keap1 will be covalently modified.Subsequent conformational changes of Keap1 result in Nrf2 relieving and translocating into nucleus to regulate antioxidant enzymes.

除了上述的Keap1依賴的Nrf2-ARE信號(hào)通路調(diào)控模式外，Nrf2也能夠通過非Keap1依賴的方式受到調(diào)控，如對(duì)于Nrf2的核轉(zhuǎn)位和降解有著重要的貢獻(xiàn)的磷酸化作用、伴侶蛋白結(jié)合、Nrf2半胱氨酸修飾等[16]。

2 基于天然產(chǎn)物及其衍生物的Nrf2激活劑

目前，絕大部分天然產(chǎn)物的Nrf2激活劑是Keap1-Nrf2相互作用間接抑制劑，它們通過同Keap1上的巰基官能團(tuán)反應(yīng)，修飾半胱氨酸殘基，導(dǎo)致Keap1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，Keap1-Nrf2復(fù)合物相互作用被破壞，Nrf2被激活?；诩せ顒┑慕Y(jié)構(gòu)以及同半胱氨酸反應(yīng)的類型，Keap1-Nrf2相互作用間接抑制劑被分成邁克爾加成受體、可氧化雙酚類、異硫氰酸酯類、二硫雜環(huán)戊烯硫酮及二烯丙基硫類、多烯化合物等類型。

2.1 邁克爾加成受體

含有α，β-不飽和羰基的邁克爾加成受體是最為常見的Nrf2激活劑，它們被認(rèn)為是溫和的路易斯酸，能夠同Keap1中的半胱氨酸殘基(溫和的路易斯堿)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)(圖2)，致使Keap1構(gòu)象發(fā)生變化，阻止了Nrf2的泛素化，進(jìn)而誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白的表達(dá)。常見的邁克爾加成受體有：姜黃素、黃酮類化合物、香豆素、肉桂酸衍生物、萜類化合物、生物堿類化合物等。

圖2 邁克爾加成受體的作用機(jī)制Fig.2 Mechanism of action of Michael addition receptor

2.1.1 姜黃素及其衍生物

姜黃素(curcumin)是從姜黃根莖中提取的黃色膳食素，被廣泛用于食品香料以及著色劑中，是一類具有代表性的抗氧化劑，近年來又被運(yùn)用于神經(jīng)退行性疾病中。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素含有α，β-不飽和羰基，屬于典型的邁克爾加成受體，能夠與半胱氨酸殘基反應(yīng)，使Keap1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路，誘導(dǎo)一系列具有抗氧化功能的Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[17]。但是，姜黃素分子結(jié)構(gòu)中存在活性亞甲基，致使其在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性較差，生物利用度極低，嚴(yán)重制約了其在臨床上的應(yīng)用[18]。為克服這一局限性，出現(xiàn)了許多致力于修飾姜黃素分子結(jié)構(gòu)的研究。

Liao等[19]通過對(duì)β-酮結(jié)構(gòu)片段的修飾，設(shè)計(jì)合成了六種姜黃素吡唑衍生物，通過測(cè)試細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放，評(píng)估了這六種化合物對(duì)硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，篩選出最佳化合物1，并驗(yàn)證得出1的神經(jīng)保護(hù)作用是通過激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

Tu等[20]通過在姜黃素活性亞甲基上引入雙甲基，改變姜黃素苯環(huán)上的取代基，設(shè)計(jì)合成了一系列姜黃素衍生物，通過評(píng)估這一系列化合物的穩(wěn)定性以及對(duì)叔丁基過氧化氫(t-BHP)誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)能力，篩選出最佳化合物2，并發(fā)現(xiàn)2能夠與機(jī)體內(nèi)的Fe2+和Cu2+反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的醌類結(jié)構(gòu)，從而激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路，增加Ⅱ相解毒酶的表達(dá)。

Li等[21]通過修飾姜黃素β-二酮部分合成了一系列的單羰基姜黃素類似物，通過測(cè)定細(xì)胞活力以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)、H2O2和SOD的表達(dá)水平，評(píng)估了這些化合物在H2O2或t-BHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)能力，篩選出最佳化合物3，并發(fā)現(xiàn)3能夠促進(jìn)HO-1和SOD的表達(dá)，在一定程度上阻止小鼠心肌細(xì)胞的損傷。

2.1.2 黃酮類化合物

黃酮(flavonoid)類化合物廣泛存在于某些植物和漿果中，其母核為2-苯基色原酮，包括黃酮、二氫黃酮、異黃酮、二氫異黃酮、查爾酮等，是一類強(qiáng)力的抗氧化劑，能夠有效的清除體內(nèi)的自由基，阻礙細(xì)胞的退化和衰老。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)槲皮素(quercetin)、二氫槲皮素(taxifolin)、山奈酚(kaempferol)、金雀異黃素(genistein)、原花青素(procyanidins)等天然黃酮類化合物能夠通過激活Nrf2-Keap-ARE信號(hào)通路來抵御機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷。

Li等[22]為尋找新型黃酮類Nrf2激活劑，對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，他們從植物中提取出了74種黃酮類化合物，通過NAD(P)H：醌還原酶(QR)分析法檢測(cè)此類化合物在Hepa1c1c7小鼠肝癌細(xì)胞中的Nrf2激活活性，篩選出活性最佳化合物4(25 μM下NAD(P)H：QR = 2.08)，并發(fā)現(xiàn)4通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)引起Nrf2磷酸化，從而激活Nrf2，增加細(xì)胞的抗氧化活性。

查爾酮(chalcone)是植物體內(nèi)合成黃酮的前體，是一類具有的抗蟲、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗真菌等藥理活性的黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，查爾酮的Nrf2激活活性比其他黃酮類化合物更顯著。因此，出現(xiàn)了許多研究致力于修飾查爾酮結(jié)構(gòu)來設(shè)計(jì)更出色的Nrf2激活劑。

首先，Kumar和Lee等[23,24]發(fā)現(xiàn)在查爾酮B環(huán)上引入三氟甲基(尤其鄰位取代)或用磺酰基代替查爾酮的α，β-不飽和羰基中的羰基能顯著增加查爾酮的Nrf2激活活性，據(jù)此，他們合成了查爾酮衍生物5(誘導(dǎo)GCLM1的表達(dá)量為蘿卜硫烷的4.5倍)和6(IC50= 1.52 μM)。隨即，三氟甲基和磺?；〈牟闋柾苌镆鹆搜芯空叩膹V泛關(guān)注，Lounsbury等[25]在Kumar等研究的基礎(chǔ)上，將B環(huán)的苯環(huán)改變?yōu)猷奏きh(huán)，設(shè)計(jì)了化合物7，發(fā)現(xiàn)經(jīng)7處理的BEAS2-2B(人正常肺上皮細(xì)胞)具有更高含量的HO-1(表達(dá)量為5的3倍)。Kim等[26]研究阿爾茲海默病時(shí)，在A環(huán)鄰位引入三氟甲基，在B環(huán)的4-引入1-丙?；哙?，合成了生物利用度大、細(xì)胞膜穿透性好的查爾酮衍生物8，8能夠在mRNA和蛋白質(zhì)水平上激活Nrf2并誘導(dǎo)HO-1和GCLC的表達(dá)，還可以抑制BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生并下調(diào)了炎癥介質(zhì)，此外，他們還發(fā)現(xiàn)8能夠恢復(fù)東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠模型的學(xué)習(xí)和記憶功能。Choi等[27]研究帕金森病過程中，在6的基礎(chǔ)上引入了改善藥物性質(zhì)的氮雜環(huán)，合成了化合物9，不僅克服了6存在的溶解度低、代謝穩(wěn)定性差、抑制細(xì)胞色素P(CYP)和對(duì)hERG(KCNH2基因)產(chǎn)生安全性隱患等缺陷，還提高了化合物的Nrf2激活活性(6：EC50= 530 nM；9：EC50= 346 nM)，他們還發(fā)現(xiàn)9能夠減輕1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘發(fā)的帕金森病小鼠模型中內(nèi)多巴胺神經(jīng)元的損傷，減緩帕金森病相關(guān)的運(yùn)動(dòng)障礙。除上述的三氟甲基和磺?；?，研究還發(fā)現(xiàn)甲氧基也能夠增強(qiáng)查爾酮的Nrf2激活活性，如Cui等[28]通過在查爾酮上引入甲氧基合成了化合物10，發(fā)現(xiàn)10能夠保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和線粒體功能障礙。

黃腐酚(xanthohumol)是由啤酒花的蛇麻腺分泌產(chǎn)生的異戊二烯基查爾酮類物質(zhì)，具有預(yù)防癌癥、糖尿病，抗菌抗病毒等生理活性。Li等[29]在研究黃腐酚對(duì)順鉑誘導(dǎo)腎毒性的保護(hù)作用和機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃腐酚能夠抑制腎臟組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)的水平，抑制順鉑引起的GSH和SOD的活性下降以及NF-κB的活化，劑量依賴性上調(diào)Nrf2和HO-1的表達(dá)，從而減輕順鉑的腎毒性。Bai等[30]設(shè)計(jì)并合成了一批黃腐酚類似物，通過測(cè)試化合物對(duì)H2O2和6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)能力，篩選出最佳化合物11和12，分子機(jī)制研究表明，化合物11和12通過促進(jìn)Nrf2的核積累從而增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)，是有效的Nrf2激活劑。

黃酮醇類(flavonols)是數(shù)量最多、分布最廣泛的一類黃酮類化合物，具有抗過敏、抗炎、抗癌等藥理活性。Roubalová等[31]合成了良好Nrf2激活活性的黃酮醇類化合物13，13能夠激活A(yù)REc32細(xì)胞中的ARE，增加RAW264.7和Hepa1c1c7細(xì)胞中Nrf2的積累，誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的HO-1的表達(dá)以及增加Hepa1c1c7細(xì)胞中NQO1、HO-1和GCLM水平。Jing等[32]在研究了黃芩素-7-甲醚(14)對(duì)高原缺氧小鼠腦組織的保護(hù)作用及機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)14預(yù)處理后能夠顯著降低高原缺氧小鼠腦組織中H2O2、MDA和NO的含量以及LDH的活性，提高抗氧化酶的活性，同時(shí)進(jìn)一步研究表明14能夠增加Nrf2和HO-1的表達(dá)，進(jìn)而緩解高原缺氧導(dǎo)致腦組織氧化應(yīng)激損傷。

2.1.3 香豆素類

香豆素(coumarin)是存在于黑香豆、香蛇鞭菊等植物的一類化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗真菌、抗凝血作用等活性。香豆素母核為苯并呋喃酮，含有α，β-不飽和羰基，能夠與半胱氨酸殘基反應(yīng)，導(dǎo)致Keap1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而激活Nrf2。

Chang等[33]通過在香豆素呋喃酮部分引入取代基，設(shè)計(jì)合成了一系列含肟或酰胺的香豆素衍生物，篩選出Nrf2激活活性最好的化合物15(EC50= 3.45 ± 0.25 μM)。Liu等[34]通過在香豆素苯環(huán)上引入取代基，設(shè)計(jì)合成了一類羥基香豆素16，16通過提高PKC磷酸化水平，破壞Nrf2-Keap1相互作用，進(jìn)而激活Nrf2，誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。Wei等[35]受到Lee和Choi等的啟發(fā)，將香豆素的呋喃酮部分結(jié)構(gòu)優(yōu)化，設(shè)計(jì)了一系列香豆素衍生的亞氨基磺酸類化合物，通過測(cè)試化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)能力，篩選出最佳化合物17，17能夠誘導(dǎo)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，上調(diào)內(nèi)源性抗氧化蛋白HO-1和NQO1的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

2.1.4 肉桂酸類

肉桂酸(cinnamic acid)是肉桂皮或安息香分離出的有機(jī)酸，結(jié)構(gòu)為苯并丙烯酸，與之結(jié)構(gòu)類似還有肉桂醛(cinnamic aldehyde)、阿魏酸(ferulic acid)、咖啡酸(caffeic acid)等。其中，阿魏酸乙酯(18)和咖啡酸苯乙酯(19)均被證實(shí)具有抗氧化作用[36,37]。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)或合成了許多含有Nrf2激活活性的苯并丙烯酸類化合物。

2008年，Wondrak等[38]在研究皮膚光老化時(shí)設(shè)計(jì)合成了一系列肉桂?；衔?，通過熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肉桂醛和1-肉桂?；?5-氧代-2-吡咯烷甲酸甲酯(20)具有Nrf2激活活性，能夠誘導(dǎo)抗氧化蛋白HO-1和NAD(P)H的表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，阻礙皮膚光老化。Nicholas等[39]在研究動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，也發(fā)現(xiàn)肉桂醛能夠激活Nrf2，此外還發(fā)現(xiàn)肉桂醛能夠抑制肥胖Ⅱ型(ZDF)大鼠中球囊損傷后的新內(nèi)膜增生。Li等[40]近期在研究骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，通過在二氫青蒿素上引入苯并丙烯酸類結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了一類具有藥理活性的青蒿素衍生物21，并指出其作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)Nrf2和NF-κB信號(hào)通路，減弱骨關(guān)節(jié)炎滑膜的炎癥反應(yīng)。

2.1.5 萜類

萜類是分子式為異戊二烯的整數(shù)倍的烯烴類化合物，部分含有α，β不飽和羰基或者共軛多烯長(zhǎng)鏈的結(jié)構(gòu)具有Nrf2激活作用。2005年，Couch等[41]通過齊墩果酸合成了一種抗炎效果的三萜類化合物CDDO，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，CDDO能夠與Cys151殘基發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，是一類潛在的Nrf2激活劑。類似的化合物還有CDDO-Me(也被稱為RTA402)，臨床前研究表明，CDDO-Me能夠激活Nrf2和抑制NF-κB，但是，在一項(xiàng)關(guān)于CDDO-Me治療慢性腎臟病的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)其在心臟方面存在安全性隱患，致使試驗(yàn)宣告失敗[42]。此外，Wang等[43]于2017年在真菌Botrysphaeria中提取了一種具有明顯的QR活性二萜類化合物22，還證實(shí)了22通過活化激酶PERK、PI3K、PKC和MEK1/2，激活Nrf2，增加NQO1和γ-GCS的表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞免受As(Ⅲ)的誘導(dǎo)損傷[44]。

2.1.6 生物堿類

蓽拔酰胺(piperlongumine)是天然植物蓽拔提取出的一類生物堿，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗真菌、抗腫瘤等活性。蓽拔酰胺是一種查爾酮類似物，含有α，β-不飽和羰基，具有潛在的Nrf2激活活性。Peng等[45]合成了一系列蓽拔酰胺類似物，篩選出細(xì)胞毒性最小的化合物23和24，研究發(fā)現(xiàn)，23和24能夠促進(jìn)Nrf2核易位，上調(diào)一系列細(xì)胞抗氧化因子的表達(dá)，從而保護(hù)PC12細(xì)胞免受氧化損傷。Li等[46]在研究腦缺血再灌注損傷時(shí)，將篩選出的具有抗氧化作用、低毒性的二酮骨架與3，4，5-三甲氧基苯基雜化，設(shè)計(jì)了一系列新穎的蓽拔酰胺類似物，其中活性最佳的化合物25是有效的Nrf2激活劑，具有更低的細(xì)胞毒性，能夠激活Nrf2，減輕體內(nèi)腦損傷。

胡椒堿(piperine)是胡椒中提取出來的一種桂皮酞胺類生物堿，具有抗氧化、抗腫瘤、抗寄生蟲、免疫調(diào)節(jié)等生物活性。此外，Choi等[47]發(fā)現(xiàn)胡椒堿，能夠劑量依賴性的增加HO-1的表達(dá)，激活Keap1-Nrf2和MAPK信號(hào)通路，從而保護(hù)細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但是由于其生物利用度低，作用機(jī)制不明確，嚴(yán)重制約了其在臨床上的運(yùn)用。為了提高胡椒堿的生物利用度，研究人員開發(fā)了大量的胡椒堿類似物。例如，Wang等[48]在研究帕金森綜合癥時(shí)合成了一系列胡椒堿類似物，通過評(píng)估化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)樣PC12細(xì)胞的氧化損傷修復(fù)能力，篩選出活性最佳化合物26，化合物26的ROS清除和細(xì)胞保護(hù)可能與Nrf2的活化，HO-1、NQO1等Ⅱ相解毒酶表達(dá)的上調(diào)有關(guān)，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，化合物26能夠減輕MPTP誘發(fā)的帕金森病小鼠模型的行為障礙，保護(hù)酪氨酸羥化酶免疫陽性的多巴胺能神經(jīng)元。Yang等[49]在研究阿爾茲海默病時(shí)，合成了一類新型胡椒堿衍生物27，27在體外具有很強(qiáng)的激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的能力，該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)27通過直接抑制了Keap1和Nrf2之間的相互作用激活Nrf2，從而抑制了氧化應(yīng)激和硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)介導(dǎo)的Nod樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體的激活。

此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)了其他生物堿類Nrf2激活劑。如Endesfelder等[50]研究發(fā)現(xiàn)咖啡因(28)能激活大腦內(nèi)Nrf2，增加Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，從而減少因高氧血癥引起的新生兒腦神經(jīng)損傷；Shu等[51]在探究荷葉總生物堿(TAL)對(duì)醋氨酚(APAP)所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)在TAL的作用下，肝內(nèi)AMPK磷酸化水平提高，導(dǎo)致Nrf2蛋白入核，HO-1和GCLC基因表達(dá)上調(diào)，從而降低血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性，下調(diào)肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA含量，上調(diào)肝組織中SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和GSH的水平，最終保護(hù)APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷。

2.2 可氧化雙酚類

多羥基酚類化合物廣泛存在于自然界中，部分多羥基酚類化合物能夠在體內(nèi)氧化成具有親電活性的醌類化合物(圖3)，與半胱氨酸的巰基反應(yīng)，使Keap1構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致Nrf2易位至細(xì)胞核中，與ARE結(jié)合并誘導(dǎo)下游Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激[52]。常見的可氧化雙酚Nrf2激活劑有兒茶酚(catechins)[53]、丹皮酚(paeonol)[54]、白藜蘆醇(resveratrol)等。此外，Son等[55]還于2013年發(fā)現(xiàn)一種能夠誘導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)原件在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的天然化合物5，7-二羥基-1，4-萘醌(29)。

圖3 多羥基酚類的作用機(jī)制

白藜蘆醇是一類具有抗氧化，強(qiáng)化血管壁、促進(jìn)腸胃消化、降低血脂肪、增加身體抵抗力、抗輻射的多羥基酚類化合物，最初是由日本學(xué)者在毛藜蘆的根莖中發(fā)現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能與Keap1半胱氨酸的硫醇基團(tuán)反應(yīng)，增加Nrf2在細(xì)胞核的釋放，增加機(jī)體內(nèi)的Ⅱ相解毒酶的表達(dá)[56]，但是白藜蘆醇溶解性差，生物半衰期短，造成白藜蘆醇在此方面的研究受限，為克服這一局限性，出現(xiàn)了許多致力于白藜蘆醇結(jié)構(gòu)修飾的研究。

2015年，Lin等[2]將白藜蘆醇的3，5，4' -三羥基易位，設(shè)計(jì)了六種白藜蘆醇羥基化類似物，以t-BHP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞作為氧化損傷模型，檢測(cè)這六種化合物的細(xì)胞保護(hù)活性，篩選出了最佳化合物30，此外，還發(fā)現(xiàn)30利用細(xì)胞內(nèi)的銅離子構(gòu)建一個(gè)有效的促氧化體系，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的鄰醌，導(dǎo)致蛋白激酶B(Akt)的磷酸化，抑制Nrf2的泛素化，從而激活Nrf2。同年，Li等[57]使用化學(xué)或酶促方法合成了三種均具有Nrf2激活活性白藜蘆醇二聚體31～33，但是它們活性均比白藜蘆醇單體低。

2.3 異硫氰酸酯類

天然的異硫氰酸酯類化合物主要以硫苷形式存在于十字花科植物當(dāng)中，具有抗腫瘤、抗氧化等活性。異硫氰酸酯類化合物含有典型的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)(-N=C=S)，該官能團(tuán)中碳原子受到雙鍵兩側(cè)的N和S原子的吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)，致使C原子具有很強(qiáng)的親電性，導(dǎo)致異硫氰酸酯能夠與半胱氨酸殘基的巰基反應(yīng)生成二硫代氨基甲酸酯(圖4)，造成Keap1構(gòu)型變化，從而激活Nrf2[58]。

蘿卜硫烷(SFP)又稱“萊菔硫烷”，典型的異硫氰酸鹽。在動(dòng)物的腎臟組織中，SFP能夠上調(diào)Nrf2和HO-1基因的表達(dá)，下調(diào)IL-6和caspase-3基因的表達(dá)[59]。Sestito等[60]在研究H2S供體治療阿爾茲海默病的過程中，將蘿卜硫烷和芥氨酸與利伐斯的明(rivastigmine)雜合，合成了六種具有抗炎抗氧化活性的化合物，其中34在5μM下具有Nrf2激活活性。

圖4 異硫氰酸酯類的作用機(jī)制Fig.4 Mechanism of action of isothiocyanates

苯乙基異硫氰酸酯(35)也是自然界中存在的常見異硫氰酸酯類化合物，2013年，Krajka-Kuzniak等[61]評(píng)估比較了異硫氰酸苯乙酯、吲哚-3-甲醇、黃腐酚和白藜蘆醇及其兩兩組合對(duì)人胰腺癌細(xì)胞中的NF-κB和Nrf2表達(dá)的影響，篩選出Nrf2激活活性最大的苯乙基異硫氰酸酯與黃腐酚組合，發(fā)現(xiàn)苯乙基異硫氰酸酯與黃腐酚組合能夠增強(qiáng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTP)、NQO1和SOD的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。

此外，Liddell等[62]發(fā)現(xiàn)一類具有Nrf2激活活性的二硫代氨基甲酸酯類化合物36，36能誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，激活Nrf2并抑制NF-кB。

2.4 二硫雜環(huán)戊烯硫酮及二烯丙基硫類

二硫雜環(huán)戊烯硫酮是對(duì)抗癌物質(zhì)具有細(xì)胞保護(hù)作用的含硫五元環(huán)狀化合物，烯丙基硫醚類化合物是一類能夠有效抑制多種癌細(xì)胞的有機(jī)硫化合物，研究發(fā)現(xiàn)，二硫雜環(huán)戊烯硫酮和二烯丙基硫類化合物中的二硫鍵能夠與半胱氨酸的巰基發(fā)生巰基-二硫鍵交換反應(yīng)[63]，修飾Keap1，抑制Nrf2的泛素化，從而上調(diào)Ⅱ相解毒酶的表達(dá)。常見的此類Nrf2激活劑有3H-1，2-二硫雜環(huán)戊烯-3-硫酮(37)和二烯丙基硫醚(38)[64]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)FDA批準(zhǔn)的最早用于治療抗血吸蟲病的藥物oltipraz也能夠增加GSH等Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，清除機(jī)體內(nèi)的ROS[65]。

2.5 多烯類化合物

多烯類化合物是具有多個(gè)單雙鍵交替的高度不飽和有機(jī)物，此類化合物在機(jī)體內(nèi)較易轉(zhuǎn)化成親電代謝產(chǎn)物，能夠同半胱氨酸殘基的巰基發(fā)生反應(yīng)，激活Nrf2。比較典型的有番茄紅素(39)和β-胡蘿卜素(40)[66]。

2.6 其他天然產(chǎn)物

除了上述的天然產(chǎn)物外，研究還發(fā)現(xiàn)其他結(jié)構(gòu)類型的天然Nrf2激活劑。如多肽類化合物，Wang等[67]從甲魚蛋白中提取出了7個(gè)抗氧化多肽，通過ARE-熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)篩選出Nrf2激活活性最佳的多肽41。

除上述比較常見的天然Nrf2激活劑外，自然界中還存在硒代化合物、過氧化物、含有離去基團(tuán)的親電試劑的天然Nrf2激活劑，甚至發(fā)現(xiàn)三價(jià)砷化合物、重金屬離子及金屬?gòu)?fù)合物等無機(jī)化合物也可以激活Keap-Nrf2-ARE信號(hào)通路。此外，Nrf2-Keap1蛋白-蛋白結(jié)合抑制劑(protein-protein interaction inhibitors，PPI)越來越受到研究人員的廣泛關(guān)注[68,69]，PPI是Keap1-Nrf2相互作用直接抑制劑，能夠直接干擾Nrf2-Keap1蛋白相互作用，致使二者解離，從而激活Nrf2發(fā)揮抗氧化防御作用[70]，目前，已有部分基于天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的PPI被報(bào)道，如Zhang等[71]從蕓香科吳茱萸中提取出的蕓香堿(rutaecarpine)，Martiniano等[72]提取的乙?；闳~素(42)和山奈酚糖苷類化合物(43)。

3 討論和展望

Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的重要機(jī)制，能夠誘導(dǎo)機(jī)體自身產(chǎn)生的一系列Ⅱ相解毒酶抵御氧化應(yīng)激。與一般抗氧化劑中和自由基不同，提高Ⅱ相解毒酶的活性可以形成一個(gè)持續(xù)的抗氧化過程，作用時(shí)間長(zhǎng)且效果佳，據(jù)此，該信號(hào)通路已成為許多疾病的靶標(biāo)[73]。天然產(chǎn)物是生物與大自然長(zhǎng)時(shí)間“斗爭(zhēng)”下的“杰作”，具有結(jié)構(gòu)多樣、活性多樣等特點(diǎn)，是藥物設(shè)計(jì)者的靈感源泉[3]。此外，許多天然產(chǎn)物具有親電性，可以修飾蛋白分子的親核部分(尤其是活性半胱氨酸殘基部位)，因此許多天然產(chǎn)物可以使Keap1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在此基礎(chǔ)上，“基于天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾開發(fā)出更佳的Nrf2激活劑”已成為熱門研究策略。但是，隨著研究的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)Keap1結(jié)構(gòu)修飾劑與半胱氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)常常是不可逆的，長(zhǎng)期作用使得Nrf2異常持續(xù)活躍有致癌變可能，此外，Nrf2過度激活還會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[74]，因此，在今后天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)優(yōu)化中，找到更合適的Nrf2激活劑尤為重要。

本文介紹了Keap1-Nrf2信號(hào)通路結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制，總結(jié)了近年來常見的天然產(chǎn)物導(dǎo)向的Nrf2激活劑，相信隨著提取技術(shù)和現(xiàn)代生物合成技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多的高活性的Nrf2激活劑將會(huì)被合成或者被發(fā)現(xiàn)，為今后治療某些疾病提供一種新的策略。