林鈺久，柴樹人，龍坤蘭，陳 駿，石冀敏，徐靜靜*

1電子科技大學(xué)醫(yī)院，成都 610054；2浙江省寧波市中醫(yī)院，寧波 315000

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，據(jù)2018年全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，男性肺癌的發(fā)病率和死亡率均位于惡性腫瘤首位，女性肺癌的發(fā)病率位于第3位，死亡率僅次于乳腺癌[1]。目前，肺癌的治療主要采用等化療來控制病情發(fā)展，延長生存期[2]。順鉑是臨床常用的一種化療藥物，但研究顯示，隨著順鉑的長期使用以及劑量的增加，會(huì)出現(xiàn)不同程度的惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫抑制等毒副作用[3]。研究肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療藥物，提高患者的生活質(zhì)量，成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。三葉青黃酮是從傳統(tǒng)中藥三葉青中提取的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化等作用，對(duì)于心肌缺血、高血壓、心絞痛等具有良好的治療效果[4]。近年來研究顯示[5]，三葉青黃酮具有抗腫瘤活性，不僅可以促進(jìn)機(jī)體的免疫功能，還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，發(fā)揮抗腫瘤作用。但三葉青黃酮調(diào)節(jié)肺癌患者免疫功能以及誘導(dǎo)腫瘤組織凋亡的機(jī)制尚未明確。因此，本研究探索了三葉青黃酮對(duì)荷Lewis肺癌小鼠免疫功能及其腫瘤組織凋亡的影響，旨在為臨床研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與動(dòng)物

FACSCanto II流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；Lewis肺癌細(xì)胞株(中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫)；順鉑(齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023461)；三葉青黃酮(浙江省中藥新藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)；轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF-β)、白介素-2(interleukin，IL-2)和IL-10檢測(cè)試劑盒(上海歌凡生物科技有限公司)；TUNEL檢測(cè)試劑盒(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司)；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、BCL2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved Caspase-3)(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(丹麥DAKO公司)。

60只SPF級(jí)C57BL/6J雌性小鼠，6～8周齡，體重均為20±2g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2015-0001，飼養(yǎng)于本院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，保持室溫恒定為25 ℃，自由攝食與飲水。

1.2 Lewis肺癌細(xì)胞懸液的制備

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將凍存Lewis肺癌細(xì)胞復(fù)蘇，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，制成細(xì)胞懸液(1×107個(gè)/mL)，取0.2 mL細(xì)胞懸液接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，接種10天后，脫頸處死小鼠，無菌剝?nèi)×鼋M織，勻漿，過濾，制成細(xì)胞懸液。

1.3 動(dòng)物造模及給藥

小鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取其中50只小鼠進(jìn)行造模，采用右側(cè)腋窩皮下注射0.2 mL Lewis肺癌細(xì)胞懸液(1×107個(gè)/mL)復(fù)制荷Lewis肺癌小鼠模型[6]，若造模后1周，肉眼可見瘤組織，則為造模成功，將造模小鼠隨機(jī)分為模型組、三葉青黃酮高、中、低劑量組和順鉑組各10只，另設(shè)10只小鼠為對(duì)照組，于右側(cè)腋窩皮下注射0.2 mL生理鹽水。接種腫瘤細(xì)胞24 h后，三葉青黃酮高、中、低劑量組灌胃0.2 mL三葉青黃酮(劑量依次為100、50、25 mg/mL)，1次/天，順鉑組腹腔注射0.5 mL順鉑(劑量為0.2mg/mL)，2次/天，模型組和對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水，各組均連續(xù)干預(yù)14天。末次給藥后，處死小鼠，收集血液，無菌分離腫瘤組織、脾臟和胸腺。

1.4 觀察各組小鼠的移植瘤體積和重量

剝離小鼠移植瘤組織，測(cè)移植瘤長徑、短徑，計(jì)算其腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2，同時(shí)稱取移植瘤重量，計(jì)算抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織重量/對(duì)照組腫瘤組織重量)×100%。

1.5 HE和TUNEL染色檢測(cè)腫瘤組織病理變化

取小鼠移植瘤組織，進(jìn)行常規(guī)切片制作，一份用于HE染色，在光鏡下觀察組織的病理變化，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野拍照；另一份用于TUNEL染色，觀察移植瘤組織細(xì)胞的凋亡情況，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.6 Western blot檢測(cè)移植瘤組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

取小鼠移植瘤組織，勻漿，使用細(xì)胞裂解液嚴(yán)格按照蛋白裂解步驟提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量、依次SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜、室溫密封2 h，洗膜并加一抗(Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3，稀釋比例均為1∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗膜加HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶5 000)室溫孵育2 h。再用電化學(xué)發(fā)光顯示，凝膠成像系統(tǒng)分析條帶強(qiáng)弱，選用β-actin作為內(nèi)參。

1.7 檢測(cè)各組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)

取小鼠胸腺和脾臟組織，用Hanks液沖洗干凈后濾紙印干，稱取胸腺和脾臟的質(zhì)量，計(jì)算小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

1.8 ELISA檢測(cè)外周血IL-2、IL-6和IL-10水平

分離腹主動(dòng)脈血液，抗凝離心(3 000 rpm，5 min)，棄上清，采用ELISA法檢測(cè)血漿IL-2、IL-6和IL-10水平。

1.9 流式細(xì)胞儀分析外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)比例

分離腹主動(dòng)脈血液，采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，PBS重懸后，加入FITC抗CD25mAb和APC抗CD4mAb各20 μL，避光孵育20 min，加入配比好的破膜劑，加入PE抗Foxp3mAb，避光孵育20 min，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析Treg細(xì)胞比例。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠移植瘤體積和重量的影響

與模型組相比，三葉青黃酮高、中劑量組和順鉑組荷瘤小鼠的腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量明顯降低(P<0.05)，且隨著三葉青黃酮?jiǎng)┝可?，其作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)；順鉑組相比，三葉青黃酮高、中劑量組荷瘤小鼠的腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量和抑瘤率明顯升高(P<0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠移植瘤的體積和重量

2.2 HE染色觀測(cè)各組荷瘤小鼠移植瘤組織的病理變化

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和三葉青黃酮低劑量組小鼠移植瘤組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，未見明顯病理變化；三葉青黃酮高、中劑量組和順鉑組移植瘤組織細(xì)胞可見明顯細(xì)胞壞死，核固縮(見圖1)。

圖1 HE染色觀測(cè)各組荷瘤小鼠移植瘤組織的病理變化(×200)Fig.1 Pathological changes of transplanted tumor tissues of tumor-bearing mice in each group were observed by HE staining (×200)

2.3 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠移植瘤組織凋亡及相關(guān)蛋白的影響

與模型組相比，順鉑組、三葉青黃酮高、中劑量組移植瘤組織細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，Bax和cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，且隨著三葉青黃酮?jiǎng)┝可?，其作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與順鉑組相比，三葉青黃酮高、中劑量組移植瘤組織細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Bax和cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯下降(P<0.05)(見圖2、表2)。

2.4 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，模型組、三葉青黃酮中、低劑量組荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯降低(P<0.05)，與模型組相比，三葉青黃酮高、中劑量組和順鉑組荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.05)，且隨著三葉青黃酮?jiǎng)┝可?，其作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與順鉑組相比，三葉青黃酮高、中劑量組荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)無明顯差異(P>0.05)(見表2)。

圖2 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠移植瘤組織凋亡的影響(×400)Fig.2 Effect of flavonoids on apoptosis of transplanted tumor tissues of tumor-bearing mice in each group (×400)注：A：TUNEL檢測(cè)移植瘤組織細(xì)胞凋亡；B：Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。Note:A:Apoptosis of transplanted tumor tissue detected by TUNEL;B:Expression of apoptosis-related proteins detected by Western blot.

表2 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠移植瘤組織凋亡及相關(guān)蛋白的影響

2.5 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠外周血細(xì)胞因子的影響

與對(duì)照組相比，模型組、順鉑組、三葉青黃酮高、中、低劑量組外周血IL-2水平明顯下降(P<0.05)，IL-10和TGF-β水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，順鉑組、三葉青黃酮高、中劑量組外周血IL-2水平明顯升高(P<0.05)，IL-10和TGF-β水平明顯下降(P<0.05)，且隨著三葉青黃酮?jiǎng)┝可?，其作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與順鉑組相比，三葉青黃酮高、中劑量組外周血IL-2、IL-10和TGF-β水平無明顯變化(P>0.05)(見表4)。

表3 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

表4 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠外周血細(xì)胞因子的影響

2.6 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠外周血Treg細(xì)胞的影響

與對(duì)照組相比，模型組、順鉑組、三葉青黃酮高、中、低劑量組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞所占比例明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，順鉑組、三葉青黃酮高、中劑量組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞所占比例明顯降低(P<0.05)，且隨著三葉青黃酮?jiǎng)┝可?，其作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與順鉑組相比，三葉青黃酮高劑量組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞所占比例明顯降低(P<0.05)，三葉青黃酮中劑量組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞所占比例明顯升高(P<0.05)(見圖3、表5)。

圖3 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠外周血Treg細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of flavonoids on Treg cells in peripheral blood of tumour-bearing mice in each group

表5 三葉青黃酮對(duì)各組荷瘤小鼠外周血Treg細(xì)胞的影響

3 討論

Lewis肺癌細(xì)胞是小鼠來源的肺腺癌細(xì)胞，常用于臨床試驗(yàn)，研究藥物治療的臨床療效[7]。順鉑是臨床最常用的化療藥物之一，對(duì)于肺癌、惡性淋巴瘤、食管癌等多種惡性腫瘤均有一定的臨床療效，但順鉑的毒副作用大大限制了其臨床應(yīng)用。因此，本研究采用Lewis肺癌細(xì)胞建立荷瘤小鼠模型，以順鉑為陽性對(duì)照，來研究藥物治療的臨床療效。三葉青黃酮是從傳統(tǒng)中藥三葉青中提取的一種黃酮類化合物，研究顯示[8]，三葉青黃酮具有良好的抗腫瘤活性，可以提高機(jī)體的免疫力，發(fā)揮抗腫瘤的作用，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。本研究中，高、中劑量的三葉青黃酮可以明顯降低移植瘤組織的體積和重量，誘導(dǎo)腫瘤壞死，且隨著劑量的增加，其作用逐漸增強(qiáng)，但高劑量三葉青黃酮的抑瘤率仍低于順鉑，提示三葉青黃酮可以呈劑量依賴性的降低移植瘤組織的體積和重量，但其作用效果明顯低于順鉑。Cheng等[9]的研究顯示，三葉青黃酮具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，有望應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療，提高化療療效，提示三葉青黃酮有望應(yīng)用于臨床輔助治療。

本研究中，高、中劑量的三葉青黃酮可以明顯上調(diào)移植瘤組織cleaved Caspase-3的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax的表達(dá)，提高移植瘤組織細(xì)胞的凋亡率，且隨著劑量的增加，其作用逐漸增強(qiáng)，但高劑量三葉青黃酮的促凋亡率仍低于順鉑，提示三葉青黃酮可以呈劑量依賴性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax是一組調(diào)控線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白，一旦細(xì)胞接收到外部信號(hào)刺激時(shí)，胞質(zhì)中的Bax會(huì)轉(zhuǎn)位至線粒體細(xì)胞膜與Bcl-2形成異源二聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，激活Caspase凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10,11]，提示三葉青黃酮可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)移植瘤組織凋亡。本研究中，高、中劑量的三葉青黃酮可以明顯升高外周血IL-2水平，降低IL-10和TGF-β水平，隨著劑量的增加，其作用逐漸增強(qiáng)，且高劑量的三葉青黃酮與順鉑作用后療效相當(dāng)。IL-2是由輔助性T細(xì)胞(Th)1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，IL-10是由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，主要調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)[12]。Zhang等[13]的研究顯示，IL-10是由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在維持機(jī)體正常的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)其水平升高可拮抗Th1功能，抑制細(xì)胞免疫，提示三葉青黃酮可以降低IL-10水平，升高IL-2水平，提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。TGF-β是由Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有免疫抑制作用，可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Kindlund等[14]的研究顯示，TGF-β和IL-10是腫瘤細(xì)胞免疫逃避的主要調(diào)控因子，可以抑制細(xì)胞免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，提示三葉青黃酮可以調(diào)節(jié)相關(guān)因子的表達(dá)，提高細(xì)胞免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

本研究中，高、中劑量的三葉青黃酮可以明顯降低Treg細(xì)胞比例，隨著劑量的增加，其作用逐漸增強(qiáng)，且高劑量的三葉青黃酮作用效應(yīng)強(qiáng)于順鉑。Treg是CD4+T細(xì)胞中的一類重要亞群，分為自然Treg(natural Treg，nTreg)和誘導(dǎo)Treg(induced Treg，iTreg)，可以通過多種機(jī)制抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能，是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵[15]。nTreg主要通過直接接觸發(fā)揮免疫抑制作用，iTreg主要通過分泌IL-10和TGF-β，發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用[16]。Foxp3是Treg細(xì)胞表面的一種分子標(biāo)記蛋白，F(xiàn)oxp3+Treg可以表達(dá)CD4、CD25及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3[17]。多項(xiàng)研究均表明[18,19]，F(xiàn)oxp3基因可影響Treg細(xì)胞發(fā)育、分化和功能，F(xiàn)oxp3+Treg對(duì)可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中的多種免疫細(xì)胞，發(fā)揮其免疫抑制作用。Miyabe等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可以分泌趨化因子與其受體特異性結(jié)合，并趨化Foxp3+Treg至腫瘤局部，使腫瘤細(xì)胞逃脫宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的惡性發(fā)展，提示三葉青黃酮可以降低Treg細(xì)胞比例，抑制IL-10和TGF-β的分泌，抑制細(xì)胞免疫功能，發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)，且其免疫調(diào)節(jié)作用效應(yīng)強(qiáng)于順鉑，有望應(yīng)臨床于臨床輔助治療，提高機(jī)體的免疫力，發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。

綜上所述，高、中劑量的三葉青黃酮可以明顯降低外周血Treg細(xì)胞比例，升高IL-2水平，降低IL-10和TGF-β水平，調(diào)節(jié)移植瘤組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)移植瘤組織凋亡，抑制移植瘤的生長，有望應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療。但本研究尚處于基礎(chǔ)研究階段，尚需大量的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證其臨床療效。