宗 朕,程 磊,陳卓靜,王 磊,汪 超,祁勇剛,柳志杰*

(湖北工業(yè)大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 武漢 430068)

1 萜類化合物生物合成系統(tǒng)研究的意義

萜類化合物是廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中的一大類天然化合物,以異戊二烯為基本骨架,在各種合成酶、修飾酶作用下生成,又稱為類異戊二烯(isoprenoid)。根據(jù)結(jié)構(gòu)中異戊二烯數(shù)目,可將其分為半萜、單萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜及多萜。在萜類化合物的合成過(guò)程中,由于合成所需的萜類合酶(terpene synthases,TPS)以及修飾酶的多樣性[1-2],使得最終生成的萜類化合物結(jié)構(gòu)繁多,種類豐富,具有多樣的生物活性及理化性質(zhì),在醫(yī)藥[3-6]、農(nóng)藥[7-8]、食品、日化用品[9-10]、能源[11]等多個(gè)領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用及廣闊的發(fā)展前景,萜類化合物在食品中的應(yīng)用見(jiàn)表1。

在半萜類化合物中,異戊醇和異戊烯醇在食品中應(yīng)用較為廣泛,異戊醇可用于食品香料的配制[12],異戊烯醇可用于食品香料檸檬醛[13]的合成。

在單萜類化合物中,薄荷醇、紫蘇醇、月桂烯和芳樟醇作為植物精油中的主要成份,是植物花、果實(shí)香味的主要來(lái)源,因此常用于食品香精香料[14-15]。

倍半萜中α-金合歡烯可作為食品香精[12]。在二萜中,甜菊糖苷作為一種天然的甜味劑在食品行業(yè)中應(yīng)用廣泛[16]。在三萜中,人參皂苷作為食藥兩用類化合物,在保健食品、醫(yī)藥中應(yīng)用廣泛。

表1 各類型萜類化合物在食品及其他領(lǐng)域中的應(yīng)用Table1 Application of various terpenoids in food and other fields

四萜和多萜類化合物在食品中應(yīng)用較多,如四萜中的番茄紅素和蝦青素均具有很強(qiáng)的抗氧化活性[17-18],可作為功能食品的功能成分;多萜中的視黃醇對(duì)維持人體正常發(fā)育以及正常視覺(jué)功能具有重要作用,維生素K對(duì)正常凝血及骨骼代謝具有重要作用,因此兩者常用作食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑。

綜上所述,萜類化合物在食品領(lǐng)域具有廣泛和重要的應(yīng)用,對(duì)人體健康及日常生活都有重要的影響。目前萜類化合物的合成方法主要有:植物提取法、化學(xué)合成法及生物合成法。相比于其他兩種方法,生物合成法生產(chǎn)不受原料限制、過(guò)程綠色環(huán)保、產(chǎn)物單一、產(chǎn)量有較大的提升空間,有更大的發(fā)展?jié)摿?實(shí)現(xiàn)萜類化合物的大規(guī)模生物合成對(duì)人類的健康、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

2 萜類化合物的生物合成

萜類化合物從其前體物質(zhì)到結(jié)構(gòu)、功能各異的終產(chǎn)物的生物合成過(guò)程包括了三個(gè)階段(見(jiàn)圖1):第一階段為中間體異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)的合成;第二階段為香葉基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)、法呢基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)、香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)等直接前體物質(zhì)的合成;第三階段為萜類化合物碳骨架的形成及修飾。

圖1 萜類化合物生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathways of terpenoids

2.1 萜類化合物中間體IPP和DMAPP的生物合成途徑

目前已發(fā)現(xiàn)的萜類化合物中間體IPP和DMAPP的生物合成途徑有兩種:2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-methy-D-erythrito-4-phosphate,MEP)途徑和甲羥戊酸(mevalonic acid,MVA)途徑。兩種途徑的差異在于前體物質(zhì)、酶以及反應(yīng)所在的亞細(xì)胞空間位置[19],但最終都生成了萜類化合物的中間體IPP和DMAPP,而且兩途徑的產(chǎn)物還可以通過(guò)質(zhì)體膜進(jìn)行交換[20]。

2.1.1 MEP途徑

MEP途徑是在20世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的一條萜類化合物中間體生物合成途徑,主要存在于細(xì)菌、藻類和植物質(zhì)體中,該途徑以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸為前體合成萜類化合物中間體IPP和DMAPP,其過(guò)程見(jiàn)圖1(A)。

在MEP途徑中,前體物質(zhì)一分子丙酮酸和一分子甘油醛-3-磷酸在1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)催化下生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸,該步驟是MEP途徑中第一個(gè)限速步驟,DXS也是該途徑中的限速酶之一[22]。之后1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸在1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶催化下生成MEP,該步反應(yīng)是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸流向的分支點(diǎn),也是MEP代謝途徑調(diào)控的重要靶點(diǎn),是MEP途徑的限速步驟,1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶也是MEP途徑中關(guān)鍵酶之一[23]。MEP再在2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶催化下生成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤蘚醇;之后4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤蘚醇在4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基赤蘚糖醇激酶催化下生成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-磷酸,生成的4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-磷酸在2-甲基赤蘚糖-2,4-環(huán)二磷酸合酶催化下生成2-C-甲基-D-赤蘚醇2,4-環(huán)二磷酸,下一步,2-C-甲基-D-赤蘚醇2,4-環(huán)二磷酸在4-羥基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶催化下生成4-羥基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸,最終4-羥基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸在4-羥基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸還原酶催化下轉(zhuǎn)化為IPP和DMAPP。

2.1.2 甲羥戊酸途徑

甲羥戊酸(mevalonate,MVA)途徑是發(fā)現(xiàn)較早的萜類化合物中間體生物合成途徑,主要存在于真核生物細(xì)胞質(zhì)中,其以乙酰輔酶A為前體合成萜類化合物中間體IPP和DMAPP,其過(guò)程見(jiàn)圖1(B)。

在MVA途徑中,首先是兩分子乙酰輔酶A在乙酰輔酶A硫解酶催化下生成乙酰乙酰輔酶A,然后乙酰乙酰輔酶A與一分子乙酰輔酶A在3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶催化下生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)。之后HMG-CoA在3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶催化下生成MVA,該步反應(yīng)是不可逆過(guò)程,所參與的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶是MVA途徑中第一個(gè)限速酶[21],對(duì)細(xì)胞質(zhì)中萜類化合物的代謝起著重要的調(diào)控作用。MVA再在甲羥戊酸激酶催化下生成甲羥戊酸-5-磷酸(mevalonate-5-phosphate,MVAP),之后MVAP在磷酸甲羥戊酸激酶催化下生成甲羥戊酸-5-焦磷酸(mevalonate-5-pyrophosphate,MVAPP),最后MVAPP在甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶催化下生成IPP。IPP在異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶催化下生成其雙鍵異構(gòu)體DMAPP。

2.2 萜類化合物直接前體GPP、FPP、GGPP的生物合成

GPP、FPP、GGPP是不同分子數(shù)目的IPP與DMAPP在不同異戊烯焦磷酸合成酶作用下生成的[23],因此三者具有不同大小的分子量,作為不同類型萜類化合物的直接前體,用于不同類型萜類化合物的合成。GPP是一分子IPP與一分子DMAPP在香葉基焦磷酸合酶催化下縮合形成,用于單萜類化合物的合成;FPP是GPP與一分子IPP在法呢基焦磷酸合酶催化下形成,用于倍半萜和三萜的合成;GGPP是FPP與一分子IPP在香葉基香葉基焦磷酸合酶的催化作用下生成,用于二萜和四萜類化合物的合成(圖1C)。

2.3 萜類化合物碳骨架的形成與修飾

GPP、FPP、GGPP在TPS催化下形成萜類化合物碳骨架或最終萜類化合物,其中單萜、倍半萜和部分二萜可以分別以GPP、FPP、GGPP為前體在TPS催化下直接合成,但部分二萜、三萜、四萜及多萜以GPP、FPP、GGPP為前體在TPS催化下形成的是最終萜類化合物的碳骨架,還需在各種修飾酶的作用下對(duì)碳骨架進(jìn)一步修飾,如環(huán)氧化、羥基化、異構(gòu)化、糖基化等[24],形成具有不同結(jié)構(gòu)功能的萜類化合物。3利用生物合成法生產(chǎn)食品用萜類化合物

圖2 食品用萜類化合物合成過(guò)程Fig.2 Synthetic process of terpenoids for food

在萜類化合物的合成方法中,生物合成法因其所具有的特點(diǎn)而成為萜類化合物工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中最具潛力的方法。目前,人們研究最多的是運(yùn)用基因工程、代謝工程以及合成生物學(xué)的方法,以微生物作為底盤細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)萜類化合物,在原核微生物中主要是大腸桿菌,真核微生物中主要是釀酒酵母和近幾年備受關(guān)注的解酯耶氏酵母。此外,在畢赤酵母[25]、紅法夫酵母[26]、馬克斯克魯維酵母[27]、谷氨酸棒狀桿菌[28]、惡臭假單胞菌[29]中也有研究。主要用于合成的食品用萜類化合物有芳樟醇、檸檬烯、α-金合歡烯、番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、蝦青素等,這些物質(zhì)生物合成過(guò)程見(jiàn)圖2。

3.1 原核微生物

大腸桿菌(Escherichiacoli)作為原核微生物中模式菌株,已對(duì)其有深入的研究,目前已作為底盤細(xì)胞用于多種食品用萜類化合物的合成。

利用E.coli內(nèi)源的MEP途徑提供萜類合成所需的前體化合物,通過(guò)異源表達(dá)各萜類合酶編碼基因,可以實(shí)現(xiàn)E.coli對(duì)各種萜類的合成。THANASOMBOON R等[30]通過(guò)向E.coli中轉(zhuǎn)入編碼GPPS和LIS的基因,使芳樟醇在大腸桿菌中的合成量接近90 mg/L。為了增加E.coli中目標(biāo)物質(zhì)的產(chǎn)量,第一個(gè)策略是增加目標(biāo)產(chǎn)物前體的供應(yīng)。在不引入外源前體合成途徑的前提下,通過(guò)過(guò)表達(dá)MEP途徑中限速酶(DXS、IDI、GPPS、FPPS)編碼基因增加中間體和直接前體的供應(yīng)以增加目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。ZHOU Y等[31]通過(guò)敲除E.coli中編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的基因zwf,過(guò)表達(dá)MEP途徑中各限速酶(idi、dxs、ispDF)基因,使工程菌株番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到6.85～7.55 mg/g菌體干質(zhì)量。為了進(jìn)一步增加目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量,僅依靠?jī)?nèi)源途徑來(lái)供應(yīng)前體,這依然是不足的,越來(lái)越多的研究在E.coli中引入了異源MVA途徑并過(guò)表達(dá)該途徑中限速酶(tHMGR、IDI)編碼基因來(lái)提供更多的前體,使萜類化合物的產(chǎn)量進(jìn)一步提高。ALONSOGUTIERREZ J等[32]在E.coli中構(gòu)建異源MVA途徑并異源表達(dá)LS的編碼基因,在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)條件下,最終檸檬烯的產(chǎn)量達(dá)到435 mg/L。KIM EM等[33]通過(guò)在E.coli中引入異源MVA途徑,過(guò)表達(dá)GPPS和來(lái)自冬青棟的MS編碼基因,使得E.coli月桂烯產(chǎn)量達(dá)到(1.67±0.029)mg/L,再利用原位分離和以甘油作為碳源等手段對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,使月桂烯最終產(chǎn)量達(dá)到(58.19±12.13)mg/L。SHENHJ等[34]利用可調(diào)的基因間隔區(qū)(thetunableintergenic regions,TIGRs)協(xié)調(diào)釀酒酵母(S.cerevisiae)中MVA途徑基因在E.coli中的異源表達(dá),使用IPP/FPP響應(yīng)啟動(dòng)子動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)TIGR介導(dǎo)的MVA途徑,防止有毒性代謝物的積累。通過(guò)代謝調(diào)控,在5L的發(fā)酵條件下,玉米黃質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到722.46 mg/L。ZHU FY等[35]通過(guò)在E.coli中引入異源MVA途徑和密碼子優(yōu)化后的番茄紅素合成基因crtE、crtB、crtI,并過(guò)表達(dá)idi基因,使得在100 L培養(yǎng)條件下,E.coli合成番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到34.3 mg/g菌體干質(zhì)量。WANG CL等[36]在E.coli中引入異源MVA途徑和密碼子優(yōu)化后的α-金合歡烯合成酶基因,并過(guò)表達(dá)內(nèi)源MEP途徑中限速酶FPPS編碼基因IspA,使E.coli生產(chǎn)α-金合歡烯的產(chǎn)量達(dá)到380 mg/L。

第二個(gè)策略是截?cái)嗷蛞种婆c目的產(chǎn)物利用共同前體的競(jìng)爭(zhēng)途徑,使前體更多地用于目標(biāo)產(chǎn)物的合成,如:敲除E.coli中g(shù)dh、zwf、iclR等基因。TAWORNSAMRETKIT I等[37]基于約束建模法中的通量分析法對(duì)合成E.coli[30]中芳樟醇合成的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,并利用單基因敲除分析法來(lái)提高芳樟醇的產(chǎn)量,在分析后發(fā)現(xiàn)與未敲除gdh基因菌株相比,敲除gdh基因后,該合成E.coli中芳樟醇的產(chǎn)量提高了14倍。CHENY Y等[38]利用CIChE整合表達(dá)載體將番茄紅素合成基因整合到E.coli基因組中,并利用三氯生誘導(dǎo)異源基因拷貝數(shù)的增加,再通過(guò)過(guò)表達(dá)基因appY,替換其天然啟動(dòng)子為T5,敲除E.coli中iclR基因等方法對(duì)E.coli合成番茄紅素的產(chǎn)量進(jìn)行優(yōu)化,使番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到33.43 mg/g菌體干質(zhì)量。

3.2 真核微生物

與原核微生物相比,真核微生物中擁有內(nèi)源MVA途徑,在前體供應(yīng)上有天然的優(yōu)勢(shì),且從安全方面講,釀酒酵母、解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)也比E.coli有更高的安全性,故利用真核微生物,特別是酵母來(lái)生產(chǎn)食品用萜類化合物有更多的研究。

在真核微生物中,為增加異源萜類化合物的合成,第一個(gè)策略是過(guò)表達(dá)MVA途徑中限速酶(HMGR、IDI、GPPS、FPPS、GGPPS)編碼基因以增加MVA途徑提供的前體,可以通過(guò)使用強(qiáng)啟動(dòng)子引導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄、增加基因拷貝數(shù)的手段實(shí)現(xiàn)基因過(guò)表達(dá)。第二個(gè)策略是對(duì)代謝途徑中關(guān)鍵酶進(jìn)行修飾以增加酶的催化活力和穩(wěn)定性,最終提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量,可以通過(guò)定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化、蛋白融合的手段來(lái)實(shí)現(xiàn)。第三個(gè)策略是通過(guò)抑制競(jìng)爭(zhēng)途徑中基因的表達(dá)、外源增加競(jìng)爭(zhēng)途徑的合成產(chǎn)物來(lái)減少競(jìng)爭(zhēng)途徑對(duì)共同前體的利用,使共同前體更多地用于目標(biāo)產(chǎn)物的合成。目前,越來(lái)越多的研究采用多策略協(xié)同實(shí)施來(lái)盡可能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。

3.2.1 釀酒酵母

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為酵母中的模式菌株,廣泛應(yīng)用于各種化合物的異源合成,在芳樟醇、β-胡蘿卜素、番茄紅素等食品用萜類的合成中有研究。

AMIRIP等[39]在S.cerevisiae中異源表達(dá)LIS的編碼基因,通過(guò)過(guò)表達(dá)tHMG1,替換啟動(dòng)子為阻遏型啟動(dòng)子MET3抑制ERG9表達(dá)的方法增加了FPP向芳樟醇合成的通量,使S.cerevisiae中芳樟醇產(chǎn)量達(dá)到95μg/L。DENGY等[40]在S.cerevisiae中將異源芳樟醇合酶與內(nèi)源FPPS以融合蛋白的形式表達(dá),通過(guò)優(yōu)化肽接頭長(zhǎng)度、蛋白連接方式以及培養(yǎng)條件,最終LIS與FPPS的N末端相連且以(GGGGS)3連接的融合蛋白使菌株芳樟醇產(chǎn)量最高,達(dá)到(240.64±5.31)μg/L。SUN Y X等[41]利用逆代謝工程的方法對(duì)S.cerevisiae異源合成β-胡蘿卜素進(jìn)行了研究。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),單獨(dú)過(guò)表達(dá)MVA途徑中基因不能高效提高β-胡蘿卜素的合成,通過(guò)外源添加不飽和脂肪酸,增加了(acetyl-CoA)合成β-胡蘿卜素的通量,最終在添加60 mg/L棕櫚油酸時(shí),S.cerevisiae異源合成β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到2.83 mg/g菌體干質(zhì)量。XIEW P等[42]利用定向進(jìn)化和代謝工程的手段構(gòu)建番茄紅素高產(chǎn)S.cerevisiae菌株。首先在S.cerevisiae中異源表達(dá)經(jīng)修飾的雙功能酶CrtYB,通過(guò)定向進(jìn)化的方法去除了該酶中的番茄紅素環(huán)化酶功能域,乃保留八氫番茄紅素合成酶的功能。第二步,將修飾后的CrtYB與來(lái)自發(fā)夫酵母的CrtE、CrtI以及釀酒酵母的tHMG1基因共表達(dá)。第三步,再通過(guò)定向進(jìn)化對(duì)CrtE進(jìn)行修飾和改變各Crt基因的拷貝數(shù)創(chuàng)造多個(gè)途徑變體對(duì)產(chǎn)量進(jìn)行優(yōu)化。最終通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵,番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到1.61 g/L。

3.2.2 解酯耶氏酵母

解酯耶氏酵母屬于非傳統(tǒng)酵母,是油脂酵母中的模式菌株,近幾年針對(duì)解酯耶氏酵母在合成生物學(xué)中的研究越來(lái)越多,在食品用萜類,尤其是疏水性萜類的異源合成中也得到了廣泛的利用。

CAOX等[43]首先在Y.lipolytica中過(guò)表達(dá)異源LIS編碼基因,實(shí)現(xiàn)了芳樟醇的異源合成。之后在對(duì)LIS與MVA途徑中酶的編碼基因(HMG1、ERG8、ERG10、ERG12、ERG19、IDI1)分別共過(guò)表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn):LIS編碼基因與IDI1共過(guò)表達(dá)時(shí)芳樟醇產(chǎn)量最高。接下來(lái)將LIS、IDI1與定點(diǎn)突變后的ERG20F88W-N119W共過(guò)表達(dá)使芳樟醇產(chǎn)量進(jìn)一步提高。最后通過(guò)以檸檬酸和丙酮酸作為碳源的搖瓶培養(yǎng),使Y.lipolytica芳樟醇產(chǎn)量達(dá)到(6.96±0.29)mg/L。CAOX等[44]在Y.lipolytica中異源表達(dá)密碼子優(yōu)化后的LS和橙花基焦磷酸合酶1(neryl diphosphate synthase 1,NDPS1)的編碼基因,實(shí)現(xiàn)了Y.lipolytica中檸檬烯的生產(chǎn)。通過(guò)過(guò)表達(dá)MVA途徑中HMGR和MK的編碼基因tHMG1和ERG12,向培養(yǎng)基中添加適量丙酮酸和十二烷對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化,使得檸檬烯在解酯耶氏酵母中的產(chǎn)量達(dá)到23.56 mg/L。YANGX等[45]將密碼子優(yōu)化后的α-金合歡烯合酶基因(optFS)在Y.lipolytica中異源表達(dá),實(shí)現(xiàn)了Y.lipolytica中α-金合歡烯的合成。通過(guò)將optFS與ERG20以融合蛋白的形式表達(dá),過(guò)表達(dá)tHMG1、IDI、ERG20的手段提高了α-金合歡烯的產(chǎn)量,最后通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵使Y.lipolytica中α-金合歡烯產(chǎn)量達(dá)到(259.98±2.15)mg/L。MATTH?USF等[46]將的來(lái)自菠蘿泛菌的crtB和crtI基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后在Y.lipolytica中異源表達(dá),并過(guò)表達(dá)類異戊二烯合成途徑中限速酶基因(GGS1、HMG1),以增加番茄紅素合成中前體的供應(yīng)。隨后,通過(guò)敲除內(nèi)源代謝中β-氧化第一步涉及基因(POX1、POX2、POX3、POX4、POX5、POX6)和編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GUT2)的方法增加胞內(nèi)脂質(zhì)體的含量,以提高胞內(nèi)番茄紅素的積累。最后,補(bǔ)料分批發(fā)酵使Y.lipolytica中番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到16 mg/g菌體干質(zhì)量。GAO SL等[47]敲除了DNA連接蛋白ku70的核心,提高了Y.lipolytica整合DNA長(zhǎng)片段的效率,通過(guò)異源表達(dá)基因carRp和carB,實(shí)現(xiàn)了β-胡蘿卜素在Y.lipolytica中的合成。之后進(jìn)行了β-胡蘿卜素合成所需的內(nèi)源基因(ERG10、ERG13、tHMGR、ERG12、ERG8、ERG19、IDI、ERG20、GGS1)和外源基因(carRP、carB、carRP)在Y.lipolytica中的多拷貝整合試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在將多拷貝carRp、tHMGR整合到Y(jié).lipolytica基因組中時(shí),β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高。最后通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵中對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化,使β-胡蘿卜素在Y.lipolytica的產(chǎn)量達(dá)到4 g/L。

4 展望

目前,雖然有多種食品用萜類化合物實(shí)現(xiàn)了微生物的生物合成,但由于受合成量較低、復(fù)雜萜類化合物不能實(shí)現(xiàn)終產(chǎn)物的合成、工程菌株性狀不穩(wěn)定等因素的制約,無(wú)法實(shí)現(xiàn)實(shí)際產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用。針對(duì)存在的問(wèn)題,一方面,隨著利用基因工程、代謝工程的手段對(duì)萜類化合物生物合成途徑更深入的研究,能夠進(jìn)一步闡明復(fù)雜萜類化合物代謝途經(jīng),鑒定其中涉及的酶及相關(guān)基因,對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的代謝進(jìn)行更加精確、適當(dāng)?shù)恼{(diào)控,以提高產(chǎn)量,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜萜類化合物完整合成。另一方面,通過(guò)基因組測(cè)序等手段,不斷增加對(duì)模式菌株性狀、功能的認(rèn)識(shí),根據(jù)不同微生物的特點(diǎn)來(lái)匹配其最適合生產(chǎn)的化合物,對(duì)微生物資源進(jìn)一步挖掘和最適的改造,使之服務(wù)于食品用萜類的低成本、規(guī)模化合成。