白寶清,李穎星,金曉弟,范三紅*

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

白酒是我國獨(dú)有的民族文化遺產(chǎn)[1],因其口感典型,千百年來受人們所青睞。清香型白酒的原料主要是高梁等谷物,用中溫大曲作為發(fā)酵劑,釀酒過程中用到了清蒸清糟釀造工藝、固態(tài)地缸發(fā)酵等[2-5],清香型白酒中香氣成分多樣,乙酸乙酯是清香型白酒中主要的香氣成分,決定著清香型白酒不同的香味和特性[6-8]。乙縮醛也是白酒中的一種香氣成分[9],具有羊乳干酪味,柔和爽口,味甜帶澀。

目前,白酒中乙酸乙酯含量檢測主要采用氣相色譜法(gaschromatography,GC),吳繼源[10]采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定白酒中乙酸乙酯含量;黃偉[11]采用內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法對白酒中乙酸乙酯含量進(jìn)行比較;譚超等[12]采用紅外光譜組合區(qū)間偏最小二乘法定量白酒中乙酸乙酯的含量;亓學(xué)奎等[13]采用毛細(xì)管色譜法測定白酒中的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯和正丙醇的含量;王延云等[14]采用氣相色譜毛細(xì)管LZP-930白酒分析專用柱測定白酒中乙酸乙酯含量;熊澤等[15]檢測了鄂西地區(qū)幾種暢銷白酒中乙酸乙酯的含量。國內(nèi)外對乙縮醛在白酒中含量檢測的文獻(xiàn)很少,黃躍勇等[16]采用氣相色譜鄰苯二甲酸二壬酯(dinonyl phthalate,DNP)不銹鋼填充柱對新蒸白酒中的乙醛與乙縮醛進(jìn)行檢測。

目前有關(guān)清香型白酒中乙酸乙酯和乙縮醛的報(bào)道較少,尚立成等[17]對氣相色譜測定清香型白酒中乙酸乙酯進(jìn)行了不確定度分析;黃偉[6]對比了內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法測量清香型白酒中乙酸乙酯含量;史靜霞等[18]利用DNP填充柱測定清香型白酒中乙酸乙酯的探討。白酒中乙酸乙酯和乙縮醛極性相似,即使采用白酒專用色譜柱和高純氦氣作為載氣時(shí),也不能將兩者完全分離開,而專用色譜柱和高純氦氣價(jià)格昂貴[14]。用氮?dú)庾鳛檩d氣在普通毛細(xì)管色譜柱上更難以分離,通常會將乙縮醛誤認(rèn)為是乙酸乙酯,從而導(dǎo)致乙酸乙酯的測定結(jié)果偏大,而乙縮醛含量則無法測定。

本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)[17]的基礎(chǔ)上,對白酒樣中加酸分解乙縮醛的步驟進(jìn)行了優(yōu)化,建立了氣相色譜檢測白酒中乙酸乙酯和乙縮醛含量的方法,并測定其在6種不同酒精度清香型白酒中的含量。以期為研究清香型白酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣(編號為Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6):6種市售清香型白酒(酒精度不同);乙醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%)、乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%)、乙縮醛標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.9%)、乙酸正戊酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%):百靈威(北京)科技有限公司;濃鹽酸(純度36%):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010氣相色譜儀:島津企業(yè)管理(中國)有限公司;Vortex-6渦旋混合器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;MYP11-2A恒溫磁力攪拌器:上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模擬酒樣、標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

模擬酒樣:用無水乙醇和蒸餾水配制模擬酒樣,酒樣中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50%。

標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確量取20 mL乙酸乙酯、10 mL乙縮醛、10 mL乙酸正戊酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液于容量瓶中,分別用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液定容至100 mL,使乙酸乙酯、乙縮醛、乙酸正戊酯的體積分?jǐn)?shù)分別為20%、10%、10%,4℃存儲備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別取0.05～2.00 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的乙縮醛標(biāo)準(zhǔn)溶液和體積分?jǐn)?shù)20%的乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液,1 mL體積分?jǐn)?shù)10%的乙酸正戊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)溶液),用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液分別定容至100 mL,使乙酸乙酯和乙縮醛的體積分?jǐn)?shù)分別為0.01%～0.40%和0.005%～0.200%,乙酸正戊酯的體積分?jǐn)?shù)為0.1%,4℃存儲備用。

分別取0.05～2.00mL體積分?jǐn)?shù)為10%的乙縮醛標(biāo)準(zhǔn)溶液和20%乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液,1 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的乙酸正戊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)溶液),1 mL 36%鹽酸溶液,用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液分別定容至100 mL,使乙酸乙酯和乙縮醛的體積分?jǐn)?shù)分別為0.01%～0.40%和0.005%～0.200%,乙酸正戊酯的體積分?jǐn)?shù)為0.1%,4℃存儲備用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱:SGEAC-20毛細(xì)管柱(30m×0.25mm,0.25μm);載氣(高純度N2):1.54mL/min;分流比:50∶1,進(jìn)樣量:1μL,尾吹氣:30 mL/min,氫氣:40 mL/min,空氣:400 mL/min,進(jìn)樣口溫度:220℃,檢測器溫度:220℃,升溫程序:起始溫度30℃,保持4 min;以5℃/min升溫至60℃,保持0 min;以8℃/min升溫至180℃,保持1 min,總分析時(shí)間26 min。

1.3.3 酒樣前處理

取2個(gè)10mL的具塞試管,向第一個(gè)試管中加入50μL的乙酸正戊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(體積分?jǐn)?shù)為10%),加樣品酒至5mL,渦旋振蕩混勻后直接GC進(jìn)樣分析;向第2個(gè)試管中的酒樣中按照50μL的36%的鹽酸溶液,加入50μL的乙酸正戊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(體積分?jǐn)?shù)為10%),加樣品酒至5 mL,渦旋振蕩混勻后放置于30℃恒溫水浴中加熱30min,然后GC進(jìn)樣分析。

1.3.4 計(jì)算方法

2 結(jié)果與分析

2.1 酒樣前處理方法討論

2.1.1 鹽酸添加量的優(yōu)化

考察鹽酸添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)對乙縮醛分解率的影響,結(jié)果如圖1所不。

圖1 鹽酸添加量對乙縮醛分解率的影響Fig.1 Effect of hydrochloric acid addition on the decomposition efficiency of acetal

由圖1可知,鹽酸添加量從0增至2.0%的過程中,溶液中酸度越大,對乙縮醛的分解效果越好。當(dāng)鹽酸添加量為1.0%時(shí),乙縮醛的分解率已達(dá)98%,繼續(xù)增加鹽酸添加量,乙縮醛分解效果無明顯提高(P＞0.05),過大的酸度可能會促使白酒中的乙酸乙酯發(fā)生部分分解,也可能會對毛細(xì)管色譜柱產(chǎn)生影響,選擇鹽酸添加量為1.0%。

2.1.2 水浴溫度的優(yōu)化

考察水浴溫度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)對乙縮醛分解率的影響,結(jié)果如圖2所不。

由圖2可知,當(dāng)酸度相同時(shí),水浴溫度越高,乙縮醛分解效果越好。當(dāng)水浴溫度由20℃升至40℃時(shí),乙縮醛分解率逐漸增大,水浴溫度為30℃時(shí)乙縮醛的分解率為98.4%;從30℃升至40℃過程中,隨溫度的升高,乙縮醛分解率乃有緩慢的提高,考慮到過高的溫度可能會使得清香型白酒中的乙酸乙酯揮發(fā),選擇水浴溫度為30℃。

圖2 水浴溫度對乙縮醛分解率的影響Fig.2 Effect of water bath temperature on the decomposition efficiency of acetal

2.1.3 水浴時(shí)間的優(yōu)化

考察水浴時(shí)間(0、0.5 h、1.0 h、1.5 h)對乙縮醛分解率影響,結(jié)果如圖3所不。

圖3 水浴時(shí)間對乙縮醛分解率的影響Fig.3 Effect of water bath time on the decomposition efficiency of acetal

由圖3可知,在30℃水浴條件下,隨水浴時(shí)間的延長乙縮醛的分解率逐漸增大。當(dāng)水浴時(shí)間為0.5 h時(shí),乙縮醛的分解率接近98.6%,當(dāng)水浴時(shí)間從0.5 h延長至1.5 h時(shí),乙縮醛的分解率增加了0.2%,變化較小,考慮到節(jié)約時(shí)間,選擇水浴時(shí)間為0.5 h。

2.1.4 最佳酸解乙縮醛條件對乙酸乙酯的影響

考察最佳酸解乙縮醛條件對乙酸乙酯含量損失的影響,結(jié)果如圖4所不。

圖4 水浴時(shí)間對乙酸乙酯損失率的影響Fig.4 Effect of water bath time on the loss rate of ethyl acetate

由圖4可知,水浴時(shí)間從0 h延長至1.5 h時(shí)乙酸乙酯損失率從0.2%增至接近0.6%。表明在最佳酸解乙縮醛條件下乙酸乙酯乃有少量的揮發(fā)。所以,在乙縮醛最佳酸解條件下對乙酸乙酯含量的測定不會產(chǎn)生明顯的影響。

2.2 檢出限、定量限和標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察結(jié)果

按照1.3.1配制乙酸乙酯體積分?jǐn)?shù)為0.02%、0.04%、0.08%、0.10%、0.20%、0.40%和乙縮醛體積分?jǐn)?shù)為0.01%、0.02%、0.04%、0.05%、0.10%、0.20%,內(nèi)標(biāo)物乙酸正戊酯的體積分?jǐn)?shù)為0.10%的系列混合標(biāo)準(zhǔn)液各兩份,其中一份不加酸,另一份鹽酸添加量為1%,分別進(jìn)行GC分析。未加酸的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的是乙縮醛和乙酸乙酯總的峰面積以及內(nèi)標(biāo)物乙酸正戊酯的峰面積;加酸的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的是乙縮醛酸解后乙酸乙酯的峰面積和內(nèi)標(biāo)物乙酸正戊酯的峰面積;乙縮醛和乙酸乙酯總的峰面積減去加酸后乙縮醛酸解后乙酸乙酯的峰面積即為乙縮醛的峰面積。以系列乙酸乙酯和乙縮醛的峰面積分別除以各自內(nèi)標(biāo)物乙酸正戊酯的峰面積得峰面積比。體積分?jǐn)?shù)-峰面積比進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將信噪比=3確定為檢出限(limit of detection,LOD);信噪比=10確定為定量限(limit of quantitation,LOQ),乙酸乙酯和乙縮醛的檢出限和定量限如表1所不。

表1 乙酸乙酯和乙縮醛的檢出限、定量限、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和線性方程Table1 Linear regression equations,linear ranges,coefficients of determination,LOD and LOQ of ethyl acetate and acetal

由表1可知,乙酸乙酯和乙縮醛在各自的體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99。

2.3 加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以樣品Y-2為加標(biāo)樣,按照2.1確定的最佳條件,使酒樣中乙酸乙酯添加體積分?jǐn)?shù)分別為0.04%、0.10%、0.20%,乙縮醛添加體積分?jǐn)?shù)分別為0.02%、0.05%、0.10%,內(nèi)標(biāo)物乙酸正戊酯添加濃度體積分?jǐn)?shù)為0.1%的溶液各兩份,其中一份鹽酸添加量1%,計(jì)算對應(yīng)體積分?jǐn)?shù)濃度的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)(n=5)。

表2 乙酸乙酯和乙縮醛的加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 The adding standard recovery rates and precision of ethyl acetate and acetal

由表2可知,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均≤7.0%,加標(biāo)回收率為95.2%～105.9%,表明該方法對乙酸乙酯和乙縮醛的檢測都有很好的精密度和準(zhǔn)確度,能夠滿足分析的要求。

2.4 實(shí)際酒樣檢測結(jié)果分析

對6種不同品牌的清香型白酒中乙酸乙酯和乙縮醛含量進(jìn)行檢測,結(jié)果如表3所不。

表3 6種清香型白酒樣品的乙酸乙酯和乙縮醛檢測結(jié)果Table3 Determination results of ethyl acetate and acetal contents in 6 Fen-flavor Baijiu samples g/L

由表3可知,6種清香型白酒中都含有乙酸乙酯和乙縮醛,其中Y-3酒樣中乙酸乙酯含量最低,為0.712 g/L,Y-5酒樣中乙酸乙酯含量最高,為1.403 g/L;乙縮醛在Y-4酒樣中含量最低,為0.132 g/L,Y-6酒樣中乙縮醛含量最高,為0.635 g/L。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過優(yōu)化乙縮醛酸性分解條件,確定鹽酸添加量為1.0%,水浴溫度為30℃,水浴時(shí)間為0.5 h,解決了酒樣中乙酸乙酯和乙縮醛由于極性非常相似在普通毛細(xì)管色譜柱上難以分離的困難,建立了采用內(nèi)標(biāo)法氣相色譜對清香型白酒中乙酸乙酯和乙縮醛含量進(jìn)行檢測的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,乙酸乙酯和乙縮醛分別在體積分?jǐn)?shù)為0.01%～0.40%和0.005%～0.200%的范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(R2＞0.99);乙酸乙酯和乙縮醛的檢出限分別為0.045 mg/L和0.021 mg/L,定量限0.090 mg/L和0.042 mg/L;加標(biāo)回收率為95.2%～105.9%。由于不同品牌的清香型白酒釀造工藝有所區(qū)別,測得6種清香白酒中乙酸乙酯的含量范圍為0.712～1.403 g/L,乙縮醛的含量為0.132～0.635 g/L。