翟紅月，敬思群，柴文杰，趙正梅

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046）

（2.韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005）

雪菊（Coreopsis tinctoria），學(xué)名雙色金雞菊，通常又稱“清三高花”[1]。新疆昆侖雪菊生長在海拔3000米以上的昆侖山北麓一帶，含有多種對人體有益的活性成分。新疆維吾爾族民間以雪菊制作茶飲，長期飲用可治療腹瀉、高血脂、腸胃不適、燥熱、高血壓等疾病[2,3]。肝臟為人體內(nèi)最復(fù)雜的代謝器官，也被視為身體的重要屏障器官。肝臟疾病在我國發(fā)病范圍較廣、發(fā)病率較高，給人們的健康造成嚴重危害，產(chǎn)生極大經(jīng)濟負擔(dān)[4]。肝細胞損傷是各型肝病的病理基礎(chǔ)，治療與糾正肝細胞損傷是各型肝病治療的主要措施之一[5,6]。此外，線粒體功能障礙可引起各種肝衰竭、肝損傷、脂肪肝等肝臟病變[7,8]。近年來，中西醫(yī)結(jié)合治療肝臟疾病的經(jīng)驗日益豐富，尤其是植物活性成分運用較為廣泛[9,10]，例如葡萄籽原花青素可能通過促進小鼠肝細胞增殖、抑制肝組織細胞凋亡和自噬，對小鼠肝損傷起到保護作用[11]；蓮房原花青素對大鼠肝損傷具有一定的保護作用，其機制可能與其抗氧化作用有關(guān)[12]，昆侖雪菊原花青素的保肝作用鮮有深入研究。

昆侖雪菊原花青素（Kunlun Chrysanthemum Proanthocyanidins, KCPC）是雪菊的次生代謝產(chǎn)物（超聲輔助法提取率為13.29%[13]）。原花青素是由不同數(shù)量的黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇聚合而成的聚合物的總稱[14]，有很強的穩(wěn)定性和抗氧化性[15,16]，能較好的清除氧游離基[17]、抑制腫瘤[18]，提高免疫力和防御紫外線輻射[19]，是一種良好的天然抗氧化劑[20,21]。前期實驗對昆侖雪菊的三種活性成分（原花青素、多糖及總黃酮，實驗室自制）進行了保肝作用研究，通過檢測小鼠血清中AST、ALT水平，發(fā)現(xiàn)昆侖雪菊多糖及總黃酮不能顯著降低小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活性，無明顯的肝保護作用，而昆侖雪菊原花青素(高劑量組)有顯著性保護作用[22]，因此本研究以此為基礎(chǔ)，擬采用CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷為模型，進一步深入探討昆侖雪菊原花青素對肝損傷的保護作用及其可能的機制，為研發(fā)治療肝臟疾病的新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊由新疆和田沙漠玫瑰有限責(zé)任公司提供，經(jīng)新疆大學(xué)阿不都拉·阿巴斯教授鑒定為兩色金雞菊Coreopsis basalis的干燥花蕾；昆侖雪菊原花青素，實驗室自制（昆侖雪菊原花青素含量為26.58 mg/g，經(jīng) AB-8大孔樹脂純化后純度為(63.76±0.34)%；HPLC-MS分離檢測出14個組分，后通過HPLC分析得表兒茶素和原花青素 B2含量分別為 12.19%、0.91%，尚未發(fā)表）；ALT、AST試劑盒、GSH-Px、SOD、MDA、SDH試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；CCl4購自天峰試劑有限公司；橄欖油，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

V-1100D型可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；邁瑞 BS-120全自動生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；FZ102-SIM真空冷凍干燥設(shè)備，德國西門子公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Anke TDL-5-A離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗動物

昆明種雄性小白鼠，購買于新疆醫(yī)學(xué)實驗動物中心（合格證號：NO.650007000，使用許可證編號：SYXK（新）2011-0001）。

1.4 試驗方法

1.4.1 CC14誘導(dǎo)肝損傷小鼠分組及處理方式

昆明種雄性小白鼠60只，4周齡，按體重隨機分為6組，分別為正常組、模型組、陽性藥物組（聯(lián)苯雙酯，300 mg/kg）、KCPC低（200 mg/kg）、中（400 mg/kg）、高劑量（800 mg/kg）給藥組（劑量設(shè)置根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果及相關(guān)參考文獻[22,23]）。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后稱重。每天一次受試組分別灌胃相應(yīng)劑量，正常組、模型組給予蒸餾水，連續(xù)給藥15 d。15 d灌胃給藥后2 h，模型組及各給藥組均腹腔注射0.1% CCl（4用橄欖油稀釋）10 mL/kg，而正常組注射不含CCl4的橄欖油10 mL/kg，禁食，18 h后取血，3000 r/min離心10 min制備血清。處死小鼠后取肝臟、胸腺、脾臟器官，稱其重量，分別計算肝臟、胸腺和脾臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

胸腺指數(shù)=胸腺濕質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

脾臟指數(shù)=脾臟濕質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

1.4.2 肝損傷生化指標的檢測

血清中的 ALT，AST水平和肝組織中 SOD，GSH-Px活性和MDA 的含量均按試劑盒說明書操作。

1.4.3 KCPC對線粒體腫脹的影響及SDH含量的影響

小鼠肝線粒體的提取參考王建華的方法[24]。取小鼠肝臟組織冰浴下以0.32 M蔗糖制成10%勻漿，將其在1500 r/min，4 ℃下離心10 min，取上清液，沉淀顆粒重懸浮于 10 mL的 1 mM的 EDTA和 10 mM Tris-HCl（pH 7.1）分離緩沖液中在相同條件下進行離心。合并兩次上清液，再以17000 r/min離心20 min。沉淀再次加入分離緩沖液洗滌離心后（7000 r/min，15 min），即為線粒體沉淀物。

將上述制備的線粒體加入 3.0 mL生理鹽水制成肝線粒體懸浮液，取0.4 mL KCPC溶液（0.5 mg/mL），于肝線粒體懸浮液中，再加入0.5 nmol/L的硫酸亞鐵溶液0.4 mL和0.5 nmol/L的Vit.C溶液0.4 mL，迅速混勻激發(fā)反應(yīng)，反應(yīng)體系放入 37 ℃水浴鍋中保溫?？瞻捉M用生理鹽水替代硫酸亞鐵和 Vit.C溶液，對照組生理鹽水替代樣品溶液。在520 nm處測定不同反應(yīng)時間后的吸光值，線粒體膜受氧化損傷而發(fā)生腫脹，吸光值下降。按照試劑盒說明檢測SDH含量，在600 nm處測定其吸光值，計算SDH活力。

1.4.4 肝組織病理組織學(xué)觀察

選取小塊肝右葉未有機械損傷處的組織，固定在預(yù)先配好的10%甲醛中，石蠟包埋切片，觀察肝組織病理變化。

1.4.5 結(jié)果統(tǒng)計

2 結(jié)果與討論

2.1 KCPC對CCl4致小鼠肝損傷肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)的影響

由表1可知，與正常組相比，模型組小鼠肝臟重量上升，肝臟指數(shù)極顯著增加（p<0.01），說明肝臟可能出現(xiàn)損傷，導(dǎo)致在一定程度上病變腫大；與模型組相比，KCPC高劑量組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低（p<0.05），為模型組的 90.55%。胸腺為體內(nèi)重要免疫器官是T淋巴細胞發(fā)育、分化的主要場所。脾臟為機體的淋巴器官，含淋巴細胞和巨噬細胞，在免疫系統(tǒng)中起重要作用。因此，胸腺和脾臟指數(shù)可作為免疫反應(yīng)功能變化的參考指標[25]。由結(jié)果可知，模型組小鼠的脾臟指數(shù)相比正常組顯著升高（p<0.05），說明CCl4激發(fā)了小鼠機體的免疫反應(yīng)，且KCPC各劑量組的胸腺和脾臟指數(shù)相比模型組均有所降低，但無顯著性差異（p>0.05）。

2.2 小鼠血清中各項生化指標的變化

ALT、AST主要分布在肝臟中，當小鼠機體受到CCl4誘導(dǎo)時，大量自由基產(chǎn)生，如三氯甲烷自由基(CCI3·)[26]等，引起膜的脂質(zhì)過氧化，從而改變肝細胞膜的通透性，導(dǎo)致細胞質(zhì)內(nèi)的ALT和AST大量外泄進入血清，在一定程度上可以反應(yīng)肝細胞的受損程度[27]。各組小鼠血清中ALT、AST活性檢測結(jié)果見圖1。

表1 KCPC對CCl4致肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響Table 1 Influence of liver coefficient of CCl4-induced liver injury in mice of KCPC (±s，n=10)

表1 KCPC對CCl4致肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響Table 1 Influence of liver coefficient of CCl4-induced liver injury in mice of KCPC (±s，n=10)

注：與正常對照組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05。

組別 肝臟指數(shù)/×10-3脾臟指數(shù)/×10-3胸腺指數(shù)/×10-3正常組 50.09±5.29 3.79±0.62 1.53±0.12模型組 58.31±3.36** 4.71±0.76* 1.77±0.35陽性組 56.10±3.61* 3.97±0.34 1.69±0.37 KCPC 低劑量組 56.65±3.62* 4.34±0.67 1.71±0.29 KCPC 中劑量組 53.86±4.83 4.20±0.66 1.63±0.18 KCPC 高劑量組 52.80±3.96# 4.17±0.63 1.65±0.34

圖1 KCPC對CCl4致肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST的影響Fig.1 Influence of serum transaminases ALT and AST of CCl4-induced liver injury in mice of KCPC (±s，n=10)

與正常組相比，模型組血清中ALT、AST顯著上升（p<0.01），表明肝細胞受到一定程度的損傷，造模成功；與模型組相比，KCPC中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST活性極顯著降低（p<0.01），其中KCPC高劑量組（800 mg/kg）ALT、AST活性分別比模型組降低了 82.46%和 69.41%，強于陽性藥物聯(lián)苯雙酯（29.15%、8.80%）。

2.3 小鼠肝臟中各項生化指標的變化

圖2 KCPC對CCl4致肝損傷小鼠肝組織SOD（圖a）、GSH-Px活性（圖b）和MDA含量（圖c）的影響Fig.2 Influence of SOD (a), GSH-Px activity (b), and MDA level(c) of CCl4-induced liver injury in mice liver tissue of KCPC(±s，n=10)

MDA是脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，為評價脂質(zhì)過氧化程度的重要指標[28]；SOD和GSH-Px是機體內(nèi)重要的抗氧化物酶，能夠評價機體清除氧自由基的能力。各組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活性及MDA含量結(jié)果見圖 2。與模型組相比，KCPC中、高劑量組肝組織SOD、GSH-Px活性顯著增加，MDA含量顯著下降（p<0.01），其中KCPC高劑量組小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性分別比模型組增加了 101.08%和92.13%，MDA含量降低了45.16%。各指標呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，隨著劑量的增大，抗氧化酶活性相應(yīng)增加，由結(jié)果可知，KCPC各劑量組能夠提高機體抗氧化酶的活性，加速體內(nèi)清除自由基的能力，降低脂質(zhì)過氧化發(fā)生，對肝損傷起到保護作用，這與鄒金發(fā)[29]等人研究原花青素對大鼠化學(xué)性肝損傷的保護作用一致，肝組織SOD活性顯著升高(p<0.01)，MDA含量顯著下降（p<0.01），表明原花青素在大鼠體內(nèi)很好的發(fā)揮了抗氧化作用，清除了自由基，保護細胞免受損傷。

2.4 KCPC對線粒體腫脹的影響及SDH活性影響

圖3 KCPC對線粒體腫脹度的影響Fig.3 Effect of KCPC on mitochondrial swelling

圖4 KCPC對CCl4致肝損傷小鼠肝臟線粒體SDH活力的影響Fig.4 Influence of SDH activity CCl4-induced liver injury in mice liver tissue of KCPC (±s，n=10)

線粒體是細胞內(nèi)能量代謝的主要場所，是多類藥物的細胞內(nèi)靶點，其結(jié)構(gòu)和功能正常對維持生物體的正?；顒佑兄匾囊饬x。采用Fe2+-Vc體系可引起線粒體的膜構(gòu)造改變，使其喪失屏障功能，內(nèi)外離子交換發(fā)生障礙。線粒體腫脹發(fā)生后，線料體懸液的渾濁度下降，使得其在520 nm處吸光值下降[30]。由圖3可以看出，正常組曲線趨于平緩，KCPC組相比對照組變化幅度較小。當Fe2+-Vc作用10~40 min時，對照組的線粒體腫脹逐漸加重，懸液渾濁度下降，吸光值明顯降低，反應(yīng)60 min時，KCPC組與正常組沒有顯著差異（OD值分別為0.747±0.034和0.702±0.024），說明 KCPC具有抑制線粒體腫脹的能力，可能是KCPC減輕了自由基導(dǎo)致的線粒體氧化損傷，恢復(fù)了ATP酶活性[31]。

SDH是一種線粒體內(nèi)膜結(jié)合的酶，參與氧化磷酸化和電子轉(zhuǎn)移的過程，為線粒體的有氧呼吸鏈提供電子，是線粒體進行三羧酸循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，因此SDH為線粒體的標志性酶，其活性反應(yīng)線粒體功能的強弱[32]。

由圖4可知，與正常組相比，模型組肝臟線粒體SDH活性顯著降低（p<0.01）；與模型組相比，KCPC中、高劑量組分別使SDH活性增加22.15%和53.76%（p<0.05或p<0.01）。隨著KCPC劑量的增加，對肝臟線粒體的保護作用越大。

2.5 肝組織病理觀察結(jié)果

圖5 不同組小鼠肝細胞HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察Fig.5 Morphology of liver cells from different groups

將固定好的肝臟組織進行石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，結(jié)果如圖 5所示。正常組肝細胞索排列整齊，有完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，細胞核大小正常，無炎性細胞浸潤（見圖 5a，5b）。模型組肝組織有多處壞死，肝細胞疏松、腫脹，細胞形態(tài)不規(guī)則，可見明顯的點狀和灶狀壞死，變性肝細胞彌漫性腫大，胞漿空泡明顯，廣泛脂肪變性，其中以肝小葉中央?yún)^(qū)最為嚴重，壞死處肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，中央靜脈及肝血竇充血水腫（見圖 5c，5d）。KCPC低劑量組和陽性對照組肝臟組織損傷有所減少，表現(xiàn)為點狀和灶狀壞死的肝細胞減少，炎性細胞減少（見圖5e，5f；5g，5h）；KCPC中、高劑量組絕大部分肝組織結(jié)構(gòu)正常，炎性細胞浸潤明顯減少，肝竇恢復(fù)正常，肝索呈放射狀排列，說明其對小鼠肝細胞的保護效果較為明顯（見圖 5i，5j；5k，5l）。

3 結(jié)論

本研究通過建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型，發(fā)現(xiàn) KCPC對肝損傷具有一定的保護作用，且隨著KCPC劑量的增加，對肝組織的保護作用越明顯，KCPC高劑量組強于陽性對照聯(lián)苯雙酯。KCPC能夠顯著降低血清中 ALT、AST的含量（p<0.01），使肝臟中MDA含量顯著下降（p<0.01)，抗氧化酶GSH-Px和SOD活力顯著升高（p<0.01)，此外，KCPC能夠抑制線粒體腫脹，顯著增加 SDH的活性（p<0.01)，減輕肝細胞線粒體的損傷。因此，推測KCPC可能通過提高抗氧化物酶的活性，從而減少氧化應(yīng)激發(fā)揮對肝細胞的保護作用。