王強，蔡一村，張揚，潘良文

（1.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

（2.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009）

肉類產(chǎn)品的種類鑒定和定量在食品安全監(jiān)測當中具有重要作用，在一些歐洲國家，所有肉類產(chǎn)品均需要明確標注動物源性成分和所占比例[1]，即便如此，肉類摻假事件仍然時有發(fā)生[2～5]，極大的增加了消費者的不信任感，損害消費者利益，對食品安全帶來挑戰(zhàn)[6～8]。不同的定性或相對定量檢測技術(shù)尤其是實時熒光PCR（real-time PCR）檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于食品和飼料的動物源性成分檢測中[9～15]。與實時熒光PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是近幾年興起的依據(jù)DNA拷貝數(shù)直接對成分進行精確定量的檢測技術(shù)[16～20]，可以不需要對照標準樣本的標準曲線來實現(xiàn)精確定量分析[21,22]。因此，數(shù)字PCR相較于實時熒光PCR具有更準確、更靈敏、抗干擾等多種優(yōu)勢[23～26]。

由于現(xiàn)實生活中肉類產(chǎn)品的定義相對廣泛，其組成成分也相對復雜，如皮膚、肌肉組織、脂肪和內(nèi)臟等均可用作食品和飼料的原料，且在同一物種中不同的成分所包含的DNA含量也不盡相同[7]，給定量檢測帶來較大困難。相較于其他形式的肉類成分，肌肉組織更常用作食品及飼料的原材料，用于直接烹飪和加工[27]。另外，線粒體基因作為靶基因在物種的定性檢測中得到了廣泛的應(yīng)用，但由于線粒體基因在同一物種的不同組織中的含量差異巨大，不利于定量檢測，而單拷貝核基因相較于線粒體基因具有拷貝數(shù)少且數(shù)量相對恒定等特點，具有準確且穩(wěn)定的定量檢測優(yōu)勢[24,28,29]，有利于對肉類產(chǎn)品的定量檢測。因此本項目利用微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)對食品和飼料中鵝源性成分的精確定量方法進行研究，通過建立單拷貝核基因的拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量之間的線性關(guān)系對鵝源性成分進行精確定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗使用的中國家鵝（Anser cygnoides domesticus）和歐洲家鵝（Anser anser domesticus）均取自揚州大學動物科學與技術(shù)學院，牛、綿羊、山羊、豬、雞、鴨、兔子、鴿子、鮭魚、鵝肉丸、燒鵝、醬鴨、五香鴨脖、鴨血、雞肉香腸、雞肉狗糧和雞肉罐頭為市售商業(yè)化肉類產(chǎn)品；水牛、馬、驢、鹿、駱駝、貓、狗、狐貍、火雞、野雞、鵪鶉和小鼠樣品均為本實驗室留存的樣品。選取動物肌肉組織切碎，利用烘箱80 ℃干燥72 h，使用液氮粉碎儀粉碎成超細粉末。

苯酚/氯仿/異戊醇、引物和探針，上海 Sangon Biotech公司；DNA提取裂解液、蛋白酶K溶液，北京Tiangen公司；醋酸鈉上海Beyotime公司；超純水美國Invitrogen公司；無水乙醇上海國藥集團化學試劑有限公司；擴增預混液（ddPCRTMSupermix for Probes）、微滴生成專用油美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UFE500AO烘箱，德國Memeert公司；BSA224s電子天平，北京Sartorius公司；SPEX 6870液氮研磨儀，美國SamplePrep公司；Vortex Genius 3震蕩儀，德國IKA公司；Thermomixer comfort恒溫震蕩孵育器、4515冷凍離心機，德國Eppendorf公司；NanoVue分光光度計，英國Biochrom公司；QX100數(shù)字PCR微滴生成儀、T100 PCR儀、QX200數(shù)字PCR微滴分析儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物與探針設(shè)計

選取中國家鵝單拷貝核基因序列（GenBank序列號：NW_013185870.1）[30]在NCBI中進行同源性比對，使用Primer Express? Software version 3.0設(shè)計引物和探針，引物及探針序列見表 1。再通過提取中國家鵝和歐洲家鵝共9個品系及其他21種動物物種的基因組DNA（表2），利用實時熒光PCR檢測技術(shù)對所設(shè)計的引物和探針的種間特異性和種內(nèi)保守性進行驗證。

表1 引物及探針序列Table 1 Primers and probe sequences

1.3.2 樣品DNA提取

使用苯酚/氯仿抽提法[31]對 10份質(zhì)量分別為10～100 mg的鵝肉粉，每份樣品3次重復，以及其他肉粉樣品（各100 mg）進行DNA提?。杭?00 μL裂解液和10 μL蛋白酶K，65 ℃恒溫震蕩孵育60 min加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇混勻后12000 r/min離心10 min，取上清液再進行一次酚/氯仿純化后加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3 M醋酸鈉（pH 5.2）混勻，置于-20 ℃沉淀30 min后，12000 r/min離心30 min，使用75%乙醇漂洗兩次并置于室溫干燥后加100 μL超純水復溶備用。

1.3.3 數(shù)字PCR檢測

ddPCR反應(yīng)體系為：上、下游引物各1.8 μL（900 nmol/L），探針 0.5 μL（250 nmol/L），ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，DNA 模板 4 μL，加水至20 μL。利用Bio-Rad QX100數(shù)字PCR微滴生成儀將20 μL體系混合物生成微滴，再利用 Bio-Rad T100 PCR儀進行擴增。ddPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)，98 ℃微滴固化10 min后，4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后利用Bio-Rad QX200微滴分析儀讀取DNA拷貝數(shù)。

1.3.4 樣品DNA含量與靶基因拷貝數(shù)關(guān)系

將提取的鵝基因組DNA系列稀釋至50、40、30、20、10、5、1 ng/μL共計7個濃度，并對上述7個濃度樣品進行ddPCR檢測，每個濃度3個重復。3次平行實驗后，以平均值建立樣品核酸含量與靶基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系式。

1.3.5 LOD和LOQ

將ddPCR定量后的DNA稀釋至100、50、10、5、1、0.1、0.01 copies/μL共計7個濃度，并對上述7個濃度樣品進行ddPCR檢測，每個濃度8個重復。通過3次平行實驗，明確該方法的LOD和LOQ。

1.3.6 準確性與適用性

提取10份質(zhì)量分數(shù)分別為 10%～100%的鵝肉粉混合樣本和鵝肉丸、燒鵝、醬鴨、五香鴨脖、鴨血、雞肉香腸、雞肉狗糧、雞肉罐頭共8種市售商品（各100 mg）的基因組DNA，稀釋后進行ddPCR檢測，利用建立的定量檢測方程，對鵝源性成分含量進行檢測，通過3次平行實驗，驗證該方法的準確性和適用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性

所選取的目標基因片段在NCBI中進行同源性比對，沒有發(fā)現(xiàn)與其它物種存在任何交叉情況出現(xiàn)。利用實時熒光 PCR檢測技術(shù)對所設(shè)計的引物和探針的特異性進行驗證，結(jié)果顯示只有中國家鵝和歐洲家鵝有特異性擴增，其他物種均無特異性擴增（表2），表明所設(shè)計的引物和探針在理論和實踐中均具有良好的種間特異性和種內(nèi)保守性。

2.2 樣品質(zhì)量與DNA含量關(guān)系

圖1 鵝肉粉質(zhì)量（mg）和核酸含量（ng/μL）間的線性關(guān)系Fig.1 Linear relationship between goose quantity (mg) and nucleic acid content (ng/μL)

使用NanoVue分光光度計將3次提取的各10份不同質(zhì)量的鵝肉粉樣品的基因組DNA進行濃度測定，每個樣品檢測3次。

結(jié)果表明鵝肉粉質(zhì)量（mg）和相應(yīng)的核酸含量（ng/μL）間存在線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998（圖1）。

表2 引物及探針種間特異性檢測結(jié)果Table 2 Exclusive specificity test results of the primer and probe

2.3 樣品DNA含量與靶基因拷貝數(shù)關(guān)系

三次平行檢測實驗的統(tǒng)計結(jié)果顯示，在濃度梯度范圍內(nèi)，鵝的核酸含量與靶基因拷貝數(shù)間存在線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998（圖2）。

圖2 DNA含量（ng/μL）與靶基因拷貝數(shù)（copies/μL）間的線性關(guān)系Fig.2 Linear relationship between target DNA content (ng/μL)and target DNA copy number (copies/μL)

2.4 建立定量檢測方程

根據(jù)樣品質(zhì)量與DNA含量之間的線性關(guān)系以及DNA含量與靶基因拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系兩個關(guān)系式，建立樣品質(zhì)量與靶基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系式如下：M goose=0.00136×C+0.856，其中C代表靶基因拷貝數(shù)（copies/μL），M代表樣品的質(zhì)量（mg）。在實際的檢測過程中，由于數(shù)字PCR的檢測范圍有限，需要對所提取的樣品基因組DNA進行稀釋至圖2所示的范圍內(nèi)，N代表稀釋倍數(shù)，則樣品質(zhì)量與靶基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系式轉(zhuǎn)化為：M goose=N×0.00136×C+0.856。

2.5 LOD和LOQ

標準規(guī)定，當檢出率≧95%時為最低檢測下限，當相對標準偏差RSD≦25%時為定量檢測下限[32]。三次平行檢測實驗的統(tǒng)計結(jié)果顯示，靶基因拷貝數(shù)在 1 copy/μL 時的檢出率≧95%，在 5 copy/μL 時的RSD≦25%，因此，該檢測方法的LOD95%和LOQ分別為1 copy/μL 和 5 copies/μL（表 3）。

表3 LOD和LOQ檢測結(jié)果Table 3 Results of the LOD and LOQ tests

2.6 準確性和適用性

表4 鵝肉粉已知含量檢測結(jié)果Table 4 Quantification of samples with known concentrations of goose material

對10份已知質(zhì)量分數(shù)的鵝肉粉混合樣品檢測結(jié)果顯示，鵝肉粉混合樣品定量檢測結(jié)果與肉粉實際質(zhì)量相對標準偏差均小于5%，相對誤差均低于±5%（表4），符合定量檢測要求，表明該ddPCR檢測方法具有較高準確性。另外，對鵝肉丸、燒鵝、醬鴨、五香鴨脖、鴨血、雞肉香腸、雞肉狗糧和雞肉罐頭共8種市售商品的檢測結(jié)果顯示，鵝肉丸和燒鵝中鵝源性成分含量分別為43.44%和56.27%，其余6種商品未檢出鵝源性成分（表5），即未發(fā)現(xiàn)鵝肉摻假其他肉類產(chǎn)品，表明該方法具有良好的適用性。

表5 市售商品定量檢測結(jié)果Table 5 Quantification results of the commercial products

3 結(jié)論

本研究選擇單拷貝核基因作為靶基因利用微滴式數(shù)字 PCR技術(shù)對食品和飼料中鵝源性成分進行檢測與精確定量，通過構(gòu)建鵝源性成分靶基因拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量之間的線性關(guān)系對鵝源性成分進行精確定量檢測，實現(xiàn)了從靶基因拷貝數(shù)到樣品實際質(zhì)量間的一步轉(zhuǎn)化，無需利用相對質(zhì)量分數(shù)來定義檢測下線和定量檢測下限，簡化了定量過程。并對該方法的特異性、檢測下限（LOD）和定量檢測下限（LOQ）分別進行了驗證，結(jié)果表明該方法具有良好的種間特異性和靈敏度，檢測下限和定量檢測下限分別為1 copy/μL和5 copies/μL；利用已知成分含量樣品和市售商品對該方法的準確性和適用性進行了驗證，結(jié)果顯示鵝肉粉混合樣品定量檢測結(jié)果與肉粉實際質(zhì)量相對標準偏差小于5%，相對誤差低于±5%，且實驗中的市售商品除明確已知的鵝源性商品外其余商品未發(fā)現(xiàn)鵝肉摻假其他肉類產(chǎn)品，說明該方法具有良好的準確性和適用性，可用于對食品和飼料中鵝源性成分進行檢測和精確定量。該定量檢測方法的建立，也可以應(yīng)用于其他肉類食品和飼料的定量檢測，為我國食品和飼料安全的市場監(jiān)管和相關(guān)執(zhí)法提供技術(shù)保障。另外，該方法還存在一定的不足之處，本研究以動物的肌肉組織為取樣材料，未能對其他動物組織如皮膚、脂肪及內(nèi)臟等進行全面的適用性驗證，今后也將對上述問題進行進一步的研究和探索。