謝志茹，程敏，譚麗容，肖雪，李莎莎

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）（2.弘正道（中國）中藥研究有限公司，廣東廣州 510623）

（3.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510006）

食用菌具有極好的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效，如抗菌、抗腫瘤、降血壓、降血脂、護(hù)肝和健胃助消化等，這可能與其中的氨基酸（AA）和蛋白質(zhì)成分有關(guān)[1,2]?；诖耍延嘘P(guān)于其蛋白質(zhì)及氨基酸的研究報(bào)道[3,4]。AA作為具有生物活性的植物次生代謝產(chǎn)物，其活性與AA的種類及含量有關(guān)，如螺旋藻水解肽的抗氧化性與其氨基酸含量有關(guān)[5]。另一項(xiàng)研究也證明食物蛋白水解物具有潛在的抗氧化活性且該活性與適當(dāng)量的特定氨基酸相關(guān)[6]。

游離氨基酸（FAAs）是人體維生素E及葉酸的來源[7]，也是提高或改善天然食品鮮味和風(fēng)味的重要成分[8,9]，如天冬氨酸及谷氨酸對(duì)紫果西番蓮的鮮味起重要作用[10]。蛋白氨基酸（PAA）為常見的組成人體蛋白質(zhì)的 20種氨基酸[11]，是蛋白質(zhì)執(zhí)行生命活動(dòng)的基礎(chǔ)物質(zhì)。非蛋白氨基酸（NPAA）如 γ-氨基丁酸、鳥氨酸作為功能性氨基酸，具有充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)、抗癌、抗菌等生物活性[12]，目前對(duì)游離氨基酸的研究多是對(duì)PAA的測(cè)定，如王富花利用HPLC法測(cè)定茶葉中17種蛋白氨基酸[13]，唐翎利用柱前衍生HPLC法測(cè)定猴頭菌絲體中 15種游離蛋白氨基酸[14]。香菇、金針菇作為常用食用菌，于海龍等利用氨基酸測(cè)定儀測(cè)定香菇子實(shí)體中常見 18種 PAA[15]，陳惜燕等利用HPLC-ELSD對(duì)包含金針菇在內(nèi)的8種食用菌的15種PAA進(jìn)行測(cè)定[16]，均缺少對(duì)NPAA的測(cè)定。故本文以香菇及金針菇為例，測(cè)定常用食用菌中的 PAA及NPAA，并通過對(duì)比氨基酸組成及含量，對(duì)其營養(yǎng)價(jià)值及風(fēng)味進(jìn)行評(píng)價(jià)。

目前對(duì)氨基酸的測(cè)定有陽離子交換色譜法及高效液相色譜法，前者準(zhǔn)確性高，但是靈敏度較低，且價(jià)格相對(duì)昂貴。后者因氨基酸屬于極性大且無紫外吸收的一類化合物，故需進(jìn)行衍生化，該方法方便快捷，故本文采用OPA-FMOC柱前衍生化HPLC法對(duì)香菇及金針菇中PAA及NPAA進(jìn)行測(cè)定，以期為食用菌的進(jìn)一步開發(fā)及利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 原材料

香菇（批號(hào)：YY02AB2016、YY05AB2016、XG16B03-170705、KDX16D04-170726、XG16E06-170830、YG03AC2016、YG02AC2016）、金針菇（批號(hào)：WLJZG170901、WLJZG170902、WLJZG170703、WLJZG170801）干品均由弘正道（中國）中藥研究有限公司提供。

1.1.2 試劑

乙腈、甲醇（HPLC級(jí)）購于德國默克公司；氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、四氫呋喃、硼酸購于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；3-巰基丙酸購于上海麥克林生化科技有限公司；鄰苯二甲醛（OPA）、氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC）購于美國Sigma公司；天冬氨酸（Asp，批號(hào) wkq16082503）、谷氨酸（Glu，批號(hào)wkq17010904）、天冬酰胺（Asn，批號(hào)wkq17010305）、絲氨酸（Ser，批號(hào)wkq16090603）、甘氨酸（Gly，批號(hào)wkq16110106）、蘇氨酸（Thr，批號(hào)wkq16090801）、精氨酸（Arg，批號(hào)wkq16090702）、丙氨酸（Ala，批號(hào) wkq17011305）、 γ-氨 基 丁 酸 （GABA，wkq17011602）、酪氨酸（Tyr，批號(hào) wkq16090304）、α-氨基丁酸（AABA，wkq17021001）、纈氨酸（Val，批號(hào) wkq16082004）、甲硫氨酸（Met，批號(hào)wkq16090704）、苯丙氨酸（Phe，批號(hào)wkq16090605）、異亮氨酸（Ile，wkq16092108）、鳥氨酸（Orn，批號(hào)wkq17020103）、亮氨酸（Leu，批號(hào) wkq16090402）、賴氨酸（Lys，批號(hào)wkq16090804）、脯氨酸（Pro，批號(hào)wkq16101204）購于四川省維克奇生物科技有限公司，純度均≥98%；純化水自制。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀（配有G1322A在線脫氣機(jī)、G1311C四元泵、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測(cè)器、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器）、Agilent ChemStation色譜工作站（版本 04.03.054.），美國Agilent公司；pH計(jì)、十萬分之一天平、萬分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；Milli-Q超純水儀系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試品的制備

香菇子實(shí)體、金針菇全株干品粉碎，過60目篩，分別取2.0 g粉末加18倍水，浸泡1 h，回流提取4 h，補(bǔ)足失重，提取液過0.22 μm微孔濾過，得供試品。

1.2.2 氨基酸測(cè)定方法的建立

依據(jù)Xiao X所做研究并進(jìn)行改進(jìn)[17]。1.2.2.1 溶液配制

OPA溶液：取OPA 80 mg，加0.4 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 10.4）7 mL，乙腈1 mL，3-巰基丙酸125 μL，溶解；FMOC溶液：取FMOC 40 mg，加乙腈8 mL溶解。

1.2.2.2 色譜條件

色譜柱：Alltima C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相A：25 mmol/L磷酸二氫鈉-四氫呋喃（體積比為 995：5，pH=7.2）；流動(dòng)相 B：50 mmol/L 磷酸二氫鈉-甲醇-乙腈（體積比為 50：35：15，pH=7.2）。梯度洗脫程序?yàn)椋?～8 min，5%～19% B；8～20 min，19%～35% B；20～34 min，35%～60% B；34～40 min，60%～70% B；40～50 min，70%～100% B；50～80 min，100%～100% B。流速：0.8 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：0～60 min，338 nm；60～80 min，262 nm。使用程序進(jìn)樣，將5 μL 樣品、5 μL 硼酸鹽緩沖液、1 μL OPA溶液、1 μL FMOC溶液、28 μL蒸餾水置于定量環(huán)中混合，進(jìn)樣20 μL。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及方法檢出限測(cè)定

準(zhǔn)確稱取AA標(biāo)準(zhǔn)品適量，用1% HCl溶液制備成1 mg/mL溶液。再將其混合，制備混標(biāo)，并進(jìn)行梯度稀釋。進(jìn)樣分析，繪制峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。并將信噪比為3時(shí)AA濃度作為檢出限。

1.2.2.4 儀器精密度考察

取香菇樣品，按 1.2.1項(xiàng)制備供試品，按1.2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄保留時(shí)間及峰面積，并計(jì)算保留時(shí)間及峰面積的RSD。

1.2.2.5 方法重復(fù)性考察

取香菇樣品，按1.2.1項(xiàng)平行制備供試品6份，按

1.2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄保留時(shí)間及峰面積，并計(jì)算保留時(shí)間及峰面積的RSD。

1.2.2.6 方法穩(wěn)定性考察

取香菇樣品，按1.2.1項(xiàng)制備供試品，于0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按1.2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄保留時(shí)間及峰面積，并計(jì)算保留時(shí)間及峰面積的RSD。

1.2.2.7 加樣回收率

取香菇樣品，按100%含量加入AA標(biāo)準(zhǔn)品，按

1.2.1項(xiàng)平行制備供試品6份，按1.2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。

1.2.3 樣品測(cè)定

取香菇、金針菇供試品，按照1.2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行氨基酸的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Agilent ChemStation工作站，根據(jù)色譜圖，對(duì)比色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中AA進(jìn)行定量分析。

味道強(qiáng)度值（taste active value，TAV）是某AA組分濃度與其味覺閾值的比值。

2 結(jié)果與討論

2.1 香菇及金針菇中AA的組成

19種AA混標(biāo)、香菇及金針菇中AA HPLC測(cè)定結(jié)果如圖1所示，在該色譜條件下可以實(shí)現(xiàn)19種AA的分離，在金針菇和香菇中AA的種類僅相差1種，金針菇中無Met。在香菇中含有15種PAA，分別為Asp、Glu、Asn、Ser、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys，2種NPAA，分別為GABA、Orn。本研究改進(jìn)Xiao X研究中的色譜條件流動(dòng)相B組成，達(dá)到AABA同Tyr，GABA同Ala的分離度大于1.5，從而實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定17種PAA和2種NPAA；一級(jí)氨基酸最大吸收波長(zhǎng)為338 nm，二級(jí)氨基酸最大吸收波長(zhǎng)為262 nm，故本研究中增添262 nm檢測(cè)波長(zhǎng)以檢測(cè)Pro。

圖1 19種AA混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（a）、金針菇（b）、香菇（c）HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed AA standards sample(a),Flammulina velutipes(b) and Letinous edodes(c)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及方法檢出限

以各AA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各AA的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，AA混標(biāo)進(jìn)行梯度稀釋后測(cè)定檢出限。結(jié)果見表1。由表 1可知在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)（r2）分布在0.9990～1.0000，說明AA峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好，此條件可用來測(cè)定AA含量。

表1 19種AA標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Regression equations and correlation coefficients for AA

2.3 儀器精密度

17種AA保留時(shí)間RSD分布在0.01%～0.26%之間，峰面積RSD分布在1.56%～4.77%間，表明儀器精密度良好。

2.4 方法重復(fù)性

17種AA保留時(shí)間RSD位于0.02%～0.34%之間，峰面積RSD位于1.72%～4.78%之間，表明該方法重復(fù)性較好。

2.5 方法穩(wěn)定性

在 24 h內(nèi)，17種 AA保留時(shí)間 RSD為0.02%～0.24%，峰面積RSD為1.41%～4.42%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.6 加樣回收率

本試驗(yàn)的加樣回收率為101.24%～105.59%之間，說明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.7 香菇及金針菇質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.7.1 香菇及金針菇PAA中EAA及FAA評(píng)價(jià)

香菇及金針菇中PAA含量測(cè)定結(jié)果如表3所示，兩種菌類中PAA含量存在較大的差異。金針菇中PAA含量為16.79 mg/g，其中有6種EAA，分別為Thr、Val、Phe、Ile、Leu、Lys，含量為 5.98 mg/g，結(jié)果與已有研究略有差異[18]，可能與金針菇的來源、品種不同有關(guān)。香菇中PAA含量為10.99 mg/g，其中EAA為7種，含量為4.39 mg/g，同金針菇中EAA相比多了Met。兩種常用食用菌中，金針菇的PAA、EAA含量較高，營養(yǎng)價(jià)值高；香菇的 EAA種類多，營養(yǎng)價(jià)值均衡。

TAV為呈味物質(zhì)測(cè)定值與呈味物質(zhì)味覺閾值的比值[19]。本研究參考的味道閾值為氨基酸的水溶液測(cè)定值[20]。由表 3可知，在香菇中大于味覺閾值的 FAA有Glu、Arg、Ala、Val、Met和Lys，其TAV值分別為8.4，1.5，2.8，1.4，4.3，1.3。在金針菇中FAA的TAV大于閾值的有Glu、Arg、Ala、Val、Phe和Lys，其TAV值分別為9.1，2.1，4.4，1.5，1.6，3.1。在香菇中，F(xiàn)AA總量為5.40 mg/g，Glu和Met為主要的FAA，其含量為3.83 mg/g，在金針菇中，F(xiàn)AA總量為9.96 mg/g，其主要FAA為Glu和Ala，含量為5.38 mg/g。Glu是鮮味氨基酸中的特征氨基酸，Ala為呈甘味的特征氨基酸[21]，Met可發(fā)生美拉德反應(yīng)而形成肉香[22]。在兩種常用食用菌中，金針菇的 FAA含量高于香菇，金針菇比香菇味道更鮮美。

2.7.2 香菇及金針菇中NPAA

NPAA是除組成人體蛋白質(zhì)的常見 20種氨基酸之外的氨基酸，且其參與神經(jīng)傳遞，具有抗癌、抗菌等生物活性[12]。兩種菌類中NPAA有GABA和Orn，香菇中NPAA含量為2.37 mg/g。金針菇中NPAA含量為3.99 mg/g。

氨基丁酸分為 α-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、β-氨基丁酸三種類型，均具有抑菌作用[23]，其中GABA屬于強(qiáng)神經(jīng)抑制氨基酸，具有多種生物活性，如鎮(zhèn)靜、降血壓、抗焦慮、抗抑郁、增強(qiáng)記憶力等[24～27]。在兩種食用菌中均檢測(cè)到GABA，且金針菇中GABA含量為2.38 mg/g，香菇中為 1.59 mg/g。作為新資源食品，SFDA允許GABA可作為食品添加劑，我國規(guī)定其攝入量不得超過500 mg/d。

鳥氨酸作為NPAA，同樣具有廣泛的生物活性，因其參與尿素循環(huán)，故對(duì)機(jī)體有一定的解毒作用，可刺激腦垂體分泌生長(zhǎng)激素，促進(jìn)糖、脂肪的代謝而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成[28]，同樣也具有增強(qiáng)免疫力、抗癌的活性[29]。在金針菇中含量為1.61 mg/g，香菇中為0.78 mg/g。金針菇中NPAA含量高于香菇，結(jié)合其增強(qiáng)免疫力，提高記憶力等保健功能，金針菇營養(yǎng)價(jià)值高于香菇。

表2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率（%）Table 2 Precision, stability, repeatability and recovery tests of AA (%)

表3 香菇、金針菇中AA含量及TAV值Table 3 Content of FAA and TAV value in Letinous edodes and Flammulina velutipes(±s, Letinous edodes: n=7; Flammulina velutipes:n=4)

表3 香菇、金針菇中AA含量及TAV值Table 3 Content of FAA and TAV value in Letinous edodes and Flammulina velutipes(±s, Letinous edodes: n=7; Flammulina velutipes:n=4)

AA 味道特征 味覺閾值/(mg/g) AA含量/(mg/g) TAV香菇 金針菇 香菇 金針菇Asp^ 鮮（+） 1.0 0.26±0.09 0.24±0.09 0.3 0.2 Glu^ 鮮（+） 0.3 2.53±0.75 2.73±0.39 8.4 9.1 Asn - - 0.41±0.11 0.34±0.07 - -Ser 甜（+） 1.5 0.44±0.07 0.86±0.18 0.3 0.6 Gly^ 甜（+） 1.3 0.30±0.10 0.79±0.17 0.2 0.6 Arg 甜/苦（+） 0.5 0.73±0.23 1.04±0.23 1.5 2.1

注：*為必需氨基酸；^為呈味氨基酸；Δ為非蛋白氨基酸；（+）為令人愉快的味道；（-）為令人不愉快的味道；-為未報(bào)道；ND為未檢出。

3 結(jié)論

3.1 本研究采用OPA-FMOC柱前自動(dòng)衍生化法對(duì)氨基酸樣品進(jìn)行測(cè)定，在該色譜條件下可實(shí)現(xiàn)19種氨基酸的分離，采用儀器自動(dòng)衍生，操作方便，結(jié)果可信，可用于金針菇、香菇中PAA及NPAA測(cè)定。

3.2 香菇中EAA種類多于金針菇，金針菇中EAA、FAA、NPAA含量均高于香菇，基于游離氨基酸，金針菇營養(yǎng)價(jià)值高，味道鮮美，香菇營養(yǎng)價(jià)值更均衡。