王慧，曹敏玲，左文彪，史琴

（貴陽中醫(yī)學(xué)院 1.功能實驗室，2.生理教研室，貴州 貴陽 550025）

腦內(nèi)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）對睡眠和覺醒功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，但5-HT濃度改變后通過何種途徑引起大腦皮質(zhì)興奮性變化尚未明確。研究表明，三磷酸腺苷（ATP）及其嘌呤P2X受體在睡眠活動的穩(wěn)態(tài)調(diào)控中起到重要的作用[1-3]，細胞內(nèi)ATP逐漸升高與非快速動眼睡眠delta波活動相一致[4]；P2X受體激動劑增加NREM睡眠而P2X受體拮抗劑則抑制大鼠NREM睡眠；P2X7受體的蛋白表達水平能隨著睡眠周期的改變而改變[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)對氯苯丙氨酸（parachlorophenylalanine, PCPA）所致的腦內(nèi)5-HT濃度下降能引起大鼠前額皮質(zhì)ATP含量下降，Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶的活性下降[6]，本研究進一步探討中樞5-HT與P2X受體及受體后信號蛋白激酶的作用關(guān)系，探討促眠藥物可能的作用環(huán)節(jié)和靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠36只。體重200～220 g（湖北省實驗動物研究中心，合格證號42000600010950），置于安靜、溫度保持恒定（22±2）℃、避免強光的環(huán)境中飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 試劑與藥物 PCPA、OxATP（非選擇性P2X受體拮抗劑）、A438079（高選擇性P2X7受體拮抗劑）和BzATP（P2X7受體激動劑）（購自美國Sigma公司），CaMKII和 PKC（美國 Abcam 公司）、P38 MAPK（CST）、二步法免疫組織化學(xué)（簡稱免疫組化）試劑盒（北京中杉金橋公司），DAB顯色劑（北京索萊寶科技有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），cDNA合成試劑盒（Gene Copoeia），熒光定量試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及處理 大鼠隨機分為6組（每組6只）：正常組、對照組、PCPA組[300 mg/（kg·d），腹腔注射，連續(xù)3 d]、OxATP、BzATP及A438079干預(yù)組，除正常組外，動物用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，固定于立體定位儀上，根據(jù)Paxinos and Watson立體定位圖譜定位腦室位置（前囟后0.8 mm，中線外1.5 mm，顱骨表面下4.5 mm），在顱骨上鉆一小孔，將單管微量給藥系統(tǒng)導(dǎo)管插入左側(cè)腦室位置，用牙托粉和牙托水固定，腹腔注射青霉素抗感染3 d，手術(shù) 7 d 后用于實驗。OxATP（4 nmol，5 μl，）、BzATP（4 nmol，5 μl）及 A438079（10 μmol，5 μl）均為腦室給藥，每天1次，連續(xù)3 d。末次給藥2 h后取大腦皮質(zhì)前額葉組織，分為左右2個部分，分別保存于-80℃冰箱及存放于10%多聚甲醛中備用。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色及分析 將前額皮質(zhì)用石蠟包埋。免疫組化采用非生物素二步法，按試劑盒說明書操作。每只大鼠選取3張400倍照片，使用IPP 6.0軟件對免疫組化照片進行光密度分析，檢測PKC、CaMKⅡ和P38 MAPK陽性細胞的平均光密度值（MD）。

1.2.3 Western blot檢測PKC、CaMKⅡ和P38 MAPK蛋白表達 將100 g組織塊置于勻漿器中加入1 ml蛋白裂解液，在冰上進行勻漿，裂解30 min后，將裂解液移至1.5 ml離心管中，4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清置于-20℃冰箱冷凍保存。對樣品進行蛋白濃度檢測，根據(jù)標準蛋白濃度和相應(yīng)的吸光值計算直線回歸方程，利用回歸方程計算出樣品蛋白濃度。將提取的蛋白上清與5倍蛋白上樣緩沖液混合，放入沸水10 min變性。配制電泳膠和濃縮膠，上樣（上樣量為40 μg）、電泳分離（濃縮膠80 V，分離膠120 V）。使用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件：GAPDH及P38 MAPK：200 mA，90 min；CaMK Ⅱ：200 mA，120 min；PKC：250 mA，120 min。進行免疫印跡顯色，用含5% 脫脂奶粉的TBST封閉液浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h，再用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗（GAPDH、P38 MAPK和PKC稀釋比為1∶1 000，CaMK Ⅱ稀釋比為1∶2 000），使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜，TBST漂洗膜5次，將PVDF膜浸泡于已用封閉液稀釋的二抗孵育液中，37℃搖床孵育2 h。TBST充分洗滌PVDF膜5次，ECL顯影，用Band Scan分析膠片灰度值。將目標蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）比值作為目標蛋白的相對表達量。

1.2.4 實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測PKC、CaMKⅡ和P38 MAPK mRNA表達 ①取-80℃冰箱中保存的新鮮冷凍的組織100 mg，Trizol法提取RNA，紫外分光光度計測定A260/A280比值，比值在1.8～2.0之間滿足實驗要求。將總RNA放于-80℃冰箱內(nèi)保存以備用。②逆轉(zhuǎn)錄：將RNA加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（按試劑盒說明書操作），逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物為北京擎科生物公司合成。引物序列見表1。③半定量RT-PCR檢測反應(yīng)體系為：內(nèi)參正向引物（10 μmol/L）0.5 μl，內(nèi)參反向引物（10 μmol/L）0.5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，ExTaq 0.25 μl，10×ExTaq E buffer 2.5 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 加至 25 μl。反應(yīng)條件為 ：94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸25 s。PCR產(chǎn)物電泳分析，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增的目的基因片段大小與設(shè)計的目的基因片段大小一致（見圖1）。④qRTPCR檢測反應(yīng)體系為cDNA（10倍稀釋）4 μl，正向引物（100 μmol/L）0.4 μl，反向引物（100 μmol/L）0.4 μl，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix （2×）10 μl，純水5.2 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s；60℃退火與延伸30 s；40個循環(huán)。獲得P38 MAPK mRNA、PKC mRNA、CaMKⅡ mRNA及GAPDH的Ct值，以目的基因相對于基礎(chǔ)值的表達量2-△△Ct反映各檢測指標的表達水平。

表1 實時定量PCR引物序列

圖1 各組大鼠前額皮質(zhì)組織P38 MAPK、PKC和CaMK Ⅱ電泳圖

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SSPS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），在方差分析有意義的基礎(chǔ)上，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠大腦皮質(zhì)P38 MAPK、PKC和CaMK Ⅱ蛋白和mRNA的表達

與對照組 [P38 MAPK（0.190±0.016），PKC（0.472±0.054），CaMK Ⅱ（0.396±0.061）]比較，PCPA 組 P38 MAPK蛋白表達增加（0.370±0.054）（t=7.838，P=0.000），而 PKC（0.258±0.025）（t=-8.881，P=0.000）和 CaMK Ⅱ（0.210±0.054）（t=-5.562，P=0.000）的蛋白表達水平下降（見圖2～5）。PCPA組的P38 MAPK mRNA表達增加，而PKC和CaMK mRNA表達水平下降（均P=0.000）。見表2。

2.2 P2X7受體在PCPA引起的受體后蛋白激酶蛋白表達變化中的作用

與 PCPA 組 [P38 MAPK（0.370±0.054），PKC（0.258±0.025），CaMK Ⅱ（0.210±0.054）]比 較，PCPA+OxATP組及PCPA+A438079組P38 MAPK蛋白 表 達 水 平 下 降 [（0.284±0.038）（0.276±0.035）（t=3.185和3.591，P=0.009和0.004）]，但BzATP組P38 MAPK蛋白表達水平升高（0.452±0.046）（t=-2.854，P=0.017）。 與 PCPA 組 比 較，PCPA+OxATP組及PCPA+A438079組PKC蛋白表達水平[（0.344±0.034）（0.376±0.026）（t=-4.963 和 -8.209，均P=0.000）]和CaMKⅡ蛋白表達水平上升[（0.308±0.052）（0.293±0.048）（t=-2.620和-2.281，P=0.009 和 0.018）]，而 PCPA+BzATP 組 PKC（0.167±0.019）（t=7.098，P=0.000）和 CaMK Ⅱ（0.112±0.024）（t=4.454，P=0.002）蛋白表達水平下降。見圖2～5。

圖2 各組大鼠大腦皮質(zhì)P38MAPK蛋白的表達 （免疫組化，×400）

圖3 各組大鼠大腦皮質(zhì)PKC蛋白的表達 （免疫組化，×400）

圖4 各組大鼠大腦皮質(zhì)CaMKⅡ蛋白的表達 （免疫組化，×400）

2.3 P2X7受體在PCPA引起的受體后蛋白激酶mRNA表達改變中的作用

PCPA+OxATP組和A438079組P38 MAPK mRNA表達水平下降，BzATP組P38 MAPK mRNA表達水平上升。OxATP及A438079能引起PKC和CaMKⅡ mRNA表達水平上升，但BzATP引起PKC及CaMKⅡ mRNA表達水平下降。見表2。

圖5 各組大鼠皮質(zhì)P38 MAPK、PKC及CaMKⅡ蛋白的相對表達量

3 討論

睡眠障礙在臨床上十分常見，已經(jīng)成為影響人們健康生活和工作的重要社會問題。眾所周知，5-HT是調(diào)節(jié)睡眠和覺醒重要的神經(jīng)遞質(zhì)，但5-HT是如何與腦內(nèi)其他調(diào)節(jié)系統(tǒng)相互作用從而調(diào)節(jié)睡眠活動目前還不清楚。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)5-HT含量下降可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活，大腦皮質(zhì)ATP含量下降，本研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)5-HT含量下降能導(dǎo)致前額皮質(zhì)細胞內(nèi)蛋白激酶P38 MAPK蛋白及基因mRNA表達增加，PKC和CaMK Ⅱ蛋白及基因mRNA表達水平下降；進一步使用P2X7受體的激動劑和拮抗劑發(fā)現(xiàn)P2X7受體參與5-HT含量下降而導(dǎo)致的該細胞內(nèi)信號蛋白激酶活動變化。

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)P38 MAPK、PKC及CaMKⅡmRNA相對表達量 （n =6）

嘌呤P2X受體是一類以ATP為配體的離子門控通道，目前已知P2X受體分為8種亞型，即P2X、P2Y、P2T、P2S、P2N、P2U、P2Z和P2D，各種亞型的P2受體可以通過激活不同的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而執(zhí)行特定的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體與睡眠和覺醒有密切的關(guān)系，P2X7受體蛋白水平能隨著睡眠周期的改變而改變[5]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，P2X7R受體廣泛分布于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞上[7]，P2X7受體興奮能引起Ca2+的內(nèi)流，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）、蛋白激酶 C（protein kinase C, PKC）和鈣調(diào)蛋白（CaM），改變P38 MAPK、PKC及CaMK等激酶的活性，引起一系列的細胞內(nèi)反應(yīng)[8-9]。研究表明，細胞外液的ATP可作用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞上的P2X7R引起睡眠的調(diào)節(jié)物質(zhì)細胞因子如白細胞介素 1（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）的釋放，該物質(zhì)作用于鄰近的神經(jīng)元，改變突觸后神經(jīng)元的敏感性[10-13]。

PCPA選擇性抑制色氨酸羥化酶活性而抑制5-HT合成，導(dǎo)致腦內(nèi)5-HT含量下降，實驗證實，腹腔注射PCPA能導(dǎo)致大鼠大腦皮質(zhì)5-HT濃度下降約80%[14]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，5-HT3受體和P2X2受體在同一神經(jīng)元上共表達，5-HT3受體遠端軸突和樹突靶向信息傳遞依賴P2X2受體的表達，且這種5-HT受體還能與其他P2X受體家族成員發(fā)生相互作用[15]。本實驗室前期實驗也發(fā)現(xiàn)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細胞上5-HT受體和P2X7受體共表達。5-HT含量下降后，可能通過5-HT受體和P2X受體的相互作用，影響P2X7受體的活性及細胞內(nèi)信號蛋白激酶的活動，改變細胞的功能狀態(tài)，影響睡眠調(diào)節(jié)物質(zhì)如細胞因子的分泌，最終影響大腦皮質(zhì)的興奮性活動。

綜上所述，腦內(nèi)5-HT下降后，可通過P2X受體介導(dǎo)細胞內(nèi)蛋白激酶P38 MAPK、PKC及CaMKⅡ蛋白及基因mRNA的表達變化，本研究有利于進一步明確促眠藥物的作用環(huán)節(jié)和作用的靶點，對新藥的研發(fā)具有重要的意義。