武懿茂，樊武哲，李紅英*，李雪垠*

(1.山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801；2.山西農業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801)

谷子(Setariaitalica(L.) P. Beauv.)是禾本科狗尾草屬二倍體(2n=2X=18)一年生草本植物[1]。谷子起源于中國[2]，是一種傳統(tǒng)的糧食作物，主要生長在中國黃河流域中上游的干旱和半干旱地區(qū)[3]，有著8700多年的栽培歷史[4]，其在中國農產品中占據(jù)著重要地位。谷子基因組較小(約510 Mb)[5]、生育期短[6]、與其它主要糧食作物親緣關系較近，已逐漸成為禾本科C4植物基因組學研究的理想模式作物[7]。

隨著全球變暖、地下水位下降、地表水源不足，干旱已經(jīng)成為制約農業(yè)生產的重要因素之一[8]，發(fā)掘作物抗旱基因、開展抗旱育種迫在眉睫。眾所周知，谷子具有耐旱、耐瘠薄和適應性強等特點，是節(jié)水減肥的理想作物[9]。因此，研究谷子抗旱機制對發(fā)掘抗旱基因、提高作物抗旱性、發(fā)展節(jié)水農業(yè)，進而保證作物產量具有重要意義[10]。

蛋白激酶(Protein Kinase, PK)是一類催化蛋白質磷酸化反應的酶，廣泛存在于植物體中[11]。蛋白激酶的催化亞基是高度保守的，在催化結構域的中心存在保守的天冬氨酸，對酶催化活性起關鍵作用[12]。蛋白激酶參與調控植物信號轉導、生長發(fā)育和抗逆等多種生理反應，在調節(jié)作物抗旱方面起著重要作用[13]。蛋白激酶主要包括PKc、CDPK、SnRK等家族，其中PKc通過調節(jié)二酰基甘油(DAG)或鈣離子(Ca2+)濃度，在信號轉導中起重要作用[14]。鈣依賴蛋白激酶(CDPK)參與植物非生物脅迫響應，研究表明轉AtCDPK1基因馬鈴薯植株抗旱性顯著增強[15]；在水稻中過表達OsCDPK7能顯著增強轉基因植株的耐旱性[16]。SnRK2家族成員在脫落酸(ABA)信號通路和介導植物干旱脅迫信號中發(fā)揮重要作用[17]。SnRK2C也可介導信號轉導，調節(jié)一系列干旱脅迫響應基因，使得擬南芥的耐旱性增強[18]；MpSnRK2.10過表達可以提高轉基因擬南芥和蘋果的抗旱性[19]。

目前，谷子中抗旱相關蛋白激酶家族基因的研究報道較少，本研究通過抗旱品種勾勾母雞咀(GG)和干旱敏感品種晉汾16(JF16)在干旱條件下的轉錄組數(shù)據(jù)，篩選并鑒定谷子抗旱相關蛋白激酶基因，對其進行生物信息學和基因表達分析，旨在為谷子抗旱相關蛋白激酶基因的發(fā)掘與功能鑒定奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 谷子抗旱相關蛋白激酶基因鑒定及染色體定位分析

勾勾母雞咀(GG)為抗旱谷子品種，晉汾16(JF16)為干旱敏感品種。為了鑒定谷子抗旱相關蛋白激酶基因，我們從干旱處理條件下勾勾母雞咀和晉汾16的轉錄組測序數(shù)據(jù)中篩選差異表達基因，篩選標準為P值<0.05、FDR值<0.05。從谷子基因組數(shù)據(jù)庫(Phytozome V12.1, https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中獲取谷子抗旱相關蛋白激酶基因的染色體位置信息，利用Tbtools[20]工具對谷子抗旱相關蛋白激酶基因的染色體定位進行可視化分析。

1.2 谷子抗旱相關蛋白激酶基因基本信息和理化性質分析

利用谷子基因組數(shù)據(jù)庫(Phytozome V12.1)查找抗旱相關蛋白激酶基因的基本信息，并利用ExPASY-ProtParam在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析谷子抗旱相關蛋白激酶的等電點和分子量。

1.3 谷子抗旱相關蛋白激酶家族系統(tǒng)進化樹構建

利用Clustal X2軟件對谷子蛋白激酶基因的氨基酸序列進行多序列比對分析，并通過鄰位相連法(Neighbor-Joining, NJ)構建系統(tǒng)進化樹，BootStrap參數(shù)設置為1 000，其它參數(shù)選擇默認。

1.4 谷子抗旱相關蛋白激酶家族基因結構分析

利用在線軟件Gene Structure Display Server(GSDS, http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析谷子抗旱相關蛋白激酶家族基因的外顯子-內含子(exon-intron)結構。

1.5 谷子抗旱相關蛋白激酶保守基序及保守結構域分析

利用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)對谷子抗旱相關蛋白激酶進行保守基序分析，利用TBtools工具繪制谷子抗旱相關蛋白激酶基因的motif示意圖，分析谷子抗旱相關蛋白激酶氨基酸序列的保守性。將谷子抗旱相關蛋白激酶基因的氨基酸序列提交至NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)，并利用TBtools工具繪制谷子抗旱相關蛋白激酶保守結構域。

1.6 谷子抗旱相關蛋白激酶基因啟動子分析

選取谷子抗旱相關蛋白激酶基因起始密碼子上游1 500 bp序列作為啟動子區(qū)域，將序列提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.gent.e/eboolslantcare/html)數(shù)據(jù)庫，分析啟動子順式作用元件。

1.7 谷子抗旱相關蛋白激酶基因表達分析

基于干旱條件下勾勾母雞咀和晉汾16的轉錄組數(shù)據(jù)，對谷子抗旱相關蛋白激酶基因進行基因表達分析。從Phytozome數(shù)據(jù)庫(V12.1) 下載谷子抗旱相關蛋白激酶基因的表達數(shù)據(jù)，分析其組織表達特異性。利用TBtools工具繪制基因表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 谷子抗旱相關蛋白激酶基因鑒定及染色體定位

對干旱條件下勾勾母雞(GG)和晉汾16(JF16)的轉錄組測序數(shù)據(jù)進行差異表達基因篩選，得到1 300個表達差異性顯著的基因,通過功能注釋鑒定出35個谷子抗旱相關蛋白激酶基因。上述基因的染色體分布情況如圖1所示，根據(jù)基因在染色體上的位置，將谷子35個蛋白激酶基因分別命為SiPK1～SiPK35。谷子抗旱相關蛋白激酶基因分布在8條不同染色體上，5號染色體上最多(9個)，7號染色體上最少(2個)，6號染色體沒有分布。

2.2 谷子抗旱相關蛋白激酶基因基本信息及理化性質

35個谷子抗旱相關蛋白激酶基因基本信息及理化性質見表1。谷子抗旱相關蛋白激酶基因長度在732～12 356 bp之間，其中SiPK10的CDS序列最長(4 890 bp)，SiPK11的CDS序列最短(261 bp)；SiPK12外顯子數(shù)目最多(20個)，SiPK2、SiPK16、SiPK30外顯子數(shù)目最少(僅有1個)；氨基酸序列的平均長度為580 aa；蛋白質等電點介于4.50(SiPK15)和9.68(SiPK3)之間，其中有13個基因編碼的蛋白質呈酸性，22個基因編碼的蛋白質顯堿性；蛋白質相對分子質量范圍37 114～178 473 Da，平均值為63 605 Da。

圖1 谷子抗旱相關蛋白激酶基因染色體定位Fig.1 Chromosomal location of protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

表1 谷子抗旱相關蛋白激酶基因基本信息及理化性質Table 1 Basic information of protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

續(xù)表1

2.3 谷子抗旱相關蛋白激酶系統(tǒng)進化及基因結構分析

基于谷子蛋白激酶基因的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹(圖2左)。谷子35個蛋白激酶可以劃分為4個亞族，同一亞族內成員親緣關系較近。亞族間外顯子數(shù)目差異較大，第Ⅰ組外顯子數(shù)目最多，第Ⅳ組外顯子數(shù)目相對較少，而亞族內成員基因結構差異較小(圖2右)。由圖1可知，親緣關系較近的蛋白激酶的基因結構也較為相近，SiPK6、SiPK34基因親緣關系較近，外顯子數(shù)目相同；SiPK23、SiPK29基因親緣關系較近，外顯子數(shù)目也相同。

外顯子-內含子結構分析顯示，多數(shù)基因包含有外顯子和內含子結構，呈現(xiàn)斷裂基因特征，其中以SiPK12基因尤為明顯，含有20個外顯子；而SiPK11基因只含有2個外顯子；SiPK2、SiPK16、SiPK30基因結構簡單，外顯子數(shù)目最少，僅有1個外顯子，沒有內含子結構。

2.4 谷子抗旱相關蛋白激酶保守基序及保守結構域

對谷子抗旱相關蛋白激酶的氨基酸序列進行保守基序分析(圖3)。谷子抗旱相關蛋白激酶家族共包含8種保守基序，將其分別命名為motif 1～8，結果顯示絕大多數(shù)谷子抗旱相關蛋白激酶含有這8種保守基序，表明谷子抗旱相關蛋白激酶中的保守基序具有較強的保守性。值得一提的是，13個谷子抗旱相關蛋白激酶都含有相同的基序并且排列順序一致，基序的保守性表明這些蛋白激酶很可能具有功能上的相似性。

保守結構域分析結果(圖4)顯示，谷子抗旱相關蛋白激酶共包含14個保守結構域，所有蛋白激酶都含有PKc結構域。13個抗旱相關蛋白激酶基因至少含有2個結構域，其中SiPK10具有5個結構域，即2個ANK、1個PKc、1個RING_Ubox和1個Ank_2保守結構域，表明該基因可能具有多種功能。SiPK16、SiPK19含有相同的保守域，即都含有1個PKc和1個AMPKA_C保守結構域，且其位置較為相似，它們可能具有相似的生物學功能。

2.5 谷子抗旱相關蛋白激酶基因啟動子順式作用元件

啟動子順式作用元件分析結果(表2、表3)顯示，谷子35個抗旱相關蛋白激酶基因啟動子中與干旱脅迫響應相關的元件主要有：ABA響應元件(ABRE)、MeJA響應元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)、干旱誘導響應元件(MBS)以及 MYB結合位點元件(MRE、CCAAT-box)等。除SiPK13、SiPK14基因以外，其他33個谷子抗旱相關蛋白激酶基因啟動子區(qū)域都含有ABA響應元件，其中SiPK21基因含有ABA響應元件的數(shù)目最多，高達19個。多數(shù)基因都含有干旱誘導響應元件(MBS)，其中SiPK1、SiPK24基因含有干旱誘導響應元件(MBS)的數(shù)目最多，同時SiPK24基因含有MYB結合位點(MRE)數(shù)量也最多，表明它們可能參與調控谷子干旱脅迫響應。此外，不同基因的調控元件種類、數(shù)目也不同，SiPK21基因的順式調控元件最多，高達44個，SiPK27基因最少，僅含有5個；一些基因還具有赤霉素(GA)、水楊酸(SA)、生長素(auxin)、低溫、脅迫響應相關的元件。

圖2 谷子抗旱相關蛋白激酶基因系統(tǒng)進化及外顯子-內含子結構分析Fig.2 Phylogenetic and exon-intron structure analyses of protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

2.6 谷子抗旱相關蛋白激酶基因表達分析

谷子抗旱相關蛋白激酶基因在干旱脅迫條件下的表達情況如圖5A所示，SiPK4、SiPK20、SiPK27等基因在不同品種和處理間的表達量都較高；SiPK25、SiPK30等基因在不同品種和處理間都有表達，但表達量較低。在同一品種勾勾母雞咀中，SiPK1、SiPK4、SiPK5、SiPK27基因在干旱處理后表達量明顯上調，說明該基因可能參與谷子干旱脅迫響應。

組織特異性表達結果如圖5B所示，SiPK8、SiPK28、SiPK29等基因在各組織中表達量較高，SiPK11、SiPK17、SiPK26等基因在各組織中表達量較低。SiPK20和SiPK25基因表現(xiàn)出顯著的組織特異性表達模式，SiPK20在葉(高光照、兩周一葉期)中表達量較高，SiPK25在根(尿素處理)中表達量較高。

圖3 谷子抗旱相關蛋白激酶氨基酸序列保守基序Fig.3 Conserved motifs in the amino acid sequences of protein kinases related to drought resistance in foxtail millet

圖4 谷子抗旱相關蛋白激酶基因保守結構域分析Fig.4 Conserved domains of protein kinases related to drought resistance in foxtail millet

表2 谷子抗旱相關蛋白激酶基因啟動子順式作用元件數(shù)目Table 2 The numbers of promoter cis-acting elements in protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

3 討論與結論

谷子是禾本科狗尾草屬二倍體C4植物，有9條染色體[21]。谷子基因組測序于2012年完成[22]，其基因組較小，約510 Mb。谷子具有耐旱、耐瘠薄的特點，是理想的抗旱模式作物。

本研究鑒定了35個谷子抗旱相關蛋白激酶基因，它們分布于除6號染色體外的其余8條染色體上。聚類分析顯示，它們可以分為4個亞家族，其中第Ⅰ亞家族成員最多?；蚪Y構分析顯示，多數(shù)基因包含有外顯子和內含子結構。保守基序分析顯示，谷子抗旱相關蛋白激酶基因家族成員共有8個保守基序。保守結構域分析表明，谷子抗旱相關蛋白激酶共包含14個保守結構域，所有蛋白激酶都含有PKc結構域。上述結果表明，多數(shù)親緣關系較近的基因的外顯子-內含子結構、保守基序、保守結構域較為相似，它們可能具有功能上的相似性，如SiPK6、SiPK34親緣關系較近，在基因結構、保守基序、保守結構域都表現(xiàn)出較強的相似性，它們可能具有相似的生物學功能。

表3 谷子抗旱相關蛋白激酶基因啟動子順式作用元件功能Table 3 Functions of promoter cis-acting elements in protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

A：谷子抗旱相關蛋白激酶基因在干旱脅迫條件下2個品種中的表達分析；B：谷子抗旱相關蛋白激酶基因在不同處理條件下14個組織中的表達分析A:Experession analyses of protein kinase genes related to drought resistance in two varieties of foxtail millet under drought stress;B:Expression analyses of protein kinase genes related to drought resistance in 14 tissues of foxtail millet under different treatments圖5 谷子抗旱相關蛋白激酶基因表達分析Fig.5 Expression analyses of protein kinase genes related to drought resistance in foxtail millet

基因表達分析顯示，在抗旱品種勾勾母雞咀(GG)中，干旱處理后SiPK1和SiPK4基因表達量顯著上升，并且SiPK1、SiPK4啟動子區(qū)域都含有干旱誘導響應元件(MBS)[SiPK1基因含有MBS的數(shù)目最多]，該元件是MYB結合位點并參與植物干旱誘導，說明SiPK1和SiPK4極有可能參與谷子干旱脅迫響應。組織特異性表達分析顯示，SiPK4和SiPK25在各組織中均有表達，且在根中表達量較高，它們可能與根部發(fā)育密切相關，而根系在植物響應干旱脅迫反應中具有重要作用[23]，這表明SiPK4可能通過調控谷子根部發(fā)育參與根部對干旱脅迫的應答反應。綜上，SiPK4基因很可能與谷子的干旱脅迫應答密切相關，可作為抗旱相關的候選基因。

谷子是耐旱性極強的作物[24]，研究其抗旱機理對小麥、水稻等作物的抗旱改良具有極其重要的意義。本研究結果表明，谷子蛋白激酶基因SiPK4很可能參與干旱脅迫響應，可作為谷子抗旱機制研究的候選基因。本研究為谷子抗旱相關蛋白激酶基因的進一步鑒定與功能研究奠定了理論基礎，為后續(xù)谷子抗旱機制的解析提供了思路。