孫 娟，楊莉娜，崔昊晶，胡文良，蘇 琳,2

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。喉癌發(fā)病隱匿，確診時(shí)多為晚期，預(yù)后不佳[2]。以手術(shù)為核心的綜合治療仍是喉癌的主要治療方式，但聲音嘶啞、吞咽困難等并發(fā)癥較為常見[3]，患者在承受手術(shù)創(chuàng)傷的同時(shí)，還要承受失聲等并發(fā)癥帶來(lái)的心理打擊。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶在調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[4]。近年來(lái)，針對(duì)蛋白激酶進(jìn)行的分子靶向治療逐漸成為臨床腫瘤治療的熱點(diǎn)，并取得了良好效果[5]，但蛋白激酶在喉癌中作為診療靶點(diǎn)的潛力仍有待進(jìn)一步挖掘。本研究利用生物信息學(xué)方法篩選與喉癌預(yù)后相關(guān)的蛋白激酶，并建立喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，通過(guò)功能分析明確預(yù)后相關(guān)蛋白激酶的作用，以期為喉癌的診療和預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 喉癌樣本獲取

從美國(guó)癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取96例喉鱗狀細(xì)胞癌患者的樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNAseq數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。96例喉癌患者中，男82例，女14例；年齡<65歲者65例，>65歲者31例；原發(fā)腫瘤浸潤(rùn)T1～T2者17例，T3～T4者79例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0者41例，N1～N3者55例；60例仍存活，36例已死亡。

1.2 喉癌預(yù)后相關(guān)蛋白激酶的篩選

利用R語(yǔ)言(版本4.0.3)limma包提取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)喉癌樣本的生存時(shí)間及生存狀態(tài)數(shù)據(jù)，再利用R語(yǔ)言survival包對(duì)蛋白激酶基因與喉癌預(yù)后生存時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行Cox單因素回歸分析，從而篩選與預(yù)后相關(guān)的基因。將蛋白激酶庫(kù)中的512個(gè)蛋白激酶基因和預(yù)后相關(guān)基因取交集后，獲得與喉癌預(yù)后相關(guān)的蛋白激酶基因。同時(shí)繪制森林圖，風(fēng)險(xiǎn)比(hazardratio，HR)>1代表高風(fēng)險(xiǎn)基因，HR<1代表保護(hù)基因。高風(fēng)險(xiǎn)基因表示蛋白激酶基因表達(dá)量與喉癌預(yù)后存在負(fù)相關(guān)，保護(hù)基因表示蛋白激酶基因表達(dá)量與喉癌預(yù)后存在正相關(guān)。

1.3 蛋白激酶基因相關(guān)喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建

利用最小絕對(duì)收縮與選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)回歸分析對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的喉癌樣本進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并構(gòu)建預(yù)后預(yù)測(cè)模型。LASSO模型通過(guò)懲罰機(jī)制篩選出與患者生存相關(guān)的關(guān)鍵基因。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值將總樣本分成高危組(高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分)和低危組(低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分)?；赗語(yǔ)言survival包比較2組患者生存差異。

1.4 喉癌預(yù)后相關(guān)蛋白激酶的GO功能分析

利用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Disco-very,DAVID)v6.8分析喉癌中與預(yù)后相關(guān)的蛋白激酶基因，分別在生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞成分(cellular component，CC)層面分析預(yù)后相關(guān)蛋白激酶在喉癌中的作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R語(yǔ)言及其相應(yīng)程序包進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用limma包進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和差異表達(dá)分析。使用survival包、glment包、survminer包構(gòu)建Cox回歸模型，P<0.05為基因與預(yù)后具有顯著相關(guān)性。利用R語(yǔ)言pROC包繪制受試者工作特征(receiveropera-tingcharacteristic，ROC)曲線，獲得該模型預(yù)測(cè)喉癌患者預(yù)后的敏感度和特異度。利用riskScore、PCA、survStat和t-SNE的R包驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因進(jìn)行功能分析，經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌預(yù)后相關(guān)蛋白激酶的篩選

基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)喉癌數(shù)據(jù)及Cox單因素回歸分析結(jié)果顯示，共有25個(gè)蛋白激酶基因與喉癌患者的預(yù)后生存時(shí)間顯著相關(guān)(P<0.05)。其中MAP3K5、IL20RA、NPM1、PLAU、LAMB3、LAMC2、IL1RAP、CDK1和CDH3等9個(gè)蛋白激酶基因是喉癌預(yù)后的高風(fēng)險(xiǎn)基因(HR>1，P<0.05)。GNG7、PRLR、ELMO1、XPA、MAP3K14、OAZ1、CD36、RGMB、NOTCH1、THEM4、MAVS、TNF、LAMP1、MSRB2、ENTPD1和GMIP等16個(gè)蛋白激酶基因是喉癌預(yù)后的保護(hù)基因(HR<1，P<0.05)，見圖1。

圖1 與喉癌預(yù)后相關(guān)的蛋白激酶基因

2.2 喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的生存分析

基于蛋白激酶基因構(gòu)建的喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型顯示，通過(guò)計(jì)算MAP3K5、PRLR、OAZ1、CD36、RGMB、NOTCH1、THEM4、MAVS、IL20RA、NPM1、PLAU、MSRB2、ENTPD1、LAMC2、CDK1和GMIP等16個(gè)蛋白激酶基因的表達(dá)量所得出的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分能夠?qū)⒑戆颖痉殖筛呶＝M和低危組。生存分析顯示，高危組的生存率顯著低于低危組(P<0.05)，見圖2。

圖2 喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的生存率分析

2.3 喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的ROC曲線分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的曲線下面積(areaunderthecurve，AUC)在生存曲線的第1～3年分別為0.778、0.782和0.815。隨著生存時(shí)間的延長(zhǎng)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC逐漸增大，提示該模型具有較高的預(yù)測(cè)喉癌預(yù)后的能力(圖3)。

圖3 喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的ROC曲線

2.4 喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型評(píng)分與患者生存驗(yàn)證

基于蛋白激酶構(gòu)建的喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的riskScore和survStat分析結(jié)果顯示，隨著患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增加，高危組的病死率明顯高于低危組(P<0.05)；PCA和t-SNE分析結(jié)果顯示，高危組和低危組的喉癌樣本分布差異顯著(P<0.05)，見圖4。證實(shí)該模型預(yù)測(cè)喉癌預(yù)后的準(zhǔn)確度較高。

a：riskScore分析；b：PCA分析；c：survStat分析；d：t-SNE分析

2.5 喉癌預(yù)后相關(guān)蛋白激酶的GO功能分析

喉癌預(yù)后相關(guān)蛋白激酶的主要BP功能包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移正性調(diào)控、NF-kappaB及JUNK等信號(hào)通路的調(diào)控等(P<0.05)；MF功能為蛋白激酶結(jié)合(P<0.05)；CC功能提示這些蛋白激酶主要通過(guò)細(xì)胞膜發(fā)揮作用(P<0.05)，見圖5。

圖5 喉癌預(yù)后相關(guān)蛋白激酶的GO功能分析

3 討論

作為信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要分子，蛋白激酶可通過(guò)磷酸化目標(biāo)蛋白使信號(hào)逐級(jí)傳遞并放大，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞移行等[6]。因此，蛋白激酶已成為抗癌治療的重要靶點(diǎn)，但蛋白激酶在癌癥預(yù)后預(yù)測(cè)方面的潛力還有待挖掘[7]。

本研究結(jié)果顯示，25個(gè)蛋白激酶基因與喉癌的預(yù)后密切相關(guān)，基于其中16個(gè)蛋白激酶基因表達(dá)量而算出的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分能夠?qū)⒑戆颖痉殖筛呶＝M與低危組，且高危組生存率顯著低于低危組。提示由多種蛋白激酶所組成的基因集能夠識(shí)別喉癌患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)，可能是預(yù)測(cè)喉癌預(yù)后的重要標(biāo)志物。這個(gè)基因集中的多個(gè)基因?qū)δ[瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用。如Takada等[8]通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)MAP3K5在喉癌中高表達(dá)，但其在喉癌中的作用還不清楚；Pressinotti等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MAP3K5在前列腺癌中高表達(dá)并能將患者分成高危組和低危組，是前列腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，MAP3K5是喉癌預(yù)后的高危因素之一，與上述研究一致，提示MAP3K5是喉癌診療的重要潛在靶點(diǎn)。Bednarek等[10]發(fā)現(xiàn)CDK1在喉癌中高表達(dá)；Lian等[11]發(fā)現(xiàn)CDK1能夠促進(jìn)喉癌細(xì)胞發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，CDK1是喉癌預(yù)后的高危因素，CDK1的表達(dá)量與喉癌患者生存時(shí)間呈反比，與上述研究結(jié)果一致，提示CDK1是預(yù)測(cè)喉癌預(yù)后的重要靶點(diǎn)。Dasgupta等[12]發(fā)現(xiàn)CDH3在頭頸部鱗癌中高表達(dá)，但作用尚不清楚。Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)在敲減CDH3后甲狀腺癌細(xì)胞增殖、侵襲被顯著抑制。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)NPM1在喉癌中高表達(dá)，敲減NPM1后喉癌細(xì)胞的凋亡率顯著增加。有研究表明，LAMB3在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)并可促進(jìn)癌癥進(jìn)展，如胰腺癌、結(jié)腸癌等[15-16]，但在喉癌中的表達(dá)情況尚不清楚。GMIP是一個(gè)腫瘤抑制因子，在肺癌和膀胱癌中發(fā)揮重要抑癌作用[17-18]；OAZ1是一個(gè)新型抑癌因子，過(guò)表達(dá)后能夠抑制非小細(xì)胞肺癌、口腔鱗癌等惡性腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移[19-20]。本研究結(jié)果顯示，以上蛋白激酶在喉癌中低表達(dá)，并與喉癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)，提示這些蛋白激酶具有作為喉癌診療新靶點(diǎn)的潛力。

有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞黏附與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，黏附分子能提高癌細(xì)胞間的黏附性，使癌細(xì)胞之間保持密切接觸，不易脫離原發(fā)癌灶而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[21]。此外，癌細(xì)胞可與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，使內(nèi)皮基底膜充分暴露，進(jìn)而促使更多癌細(xì)胞與基底膜黏附[22]。蛋白激酶在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如CDK1能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期使細(xì)胞黏著斑發(fā)生變化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[23]。蛋白激酶與細(xì)胞遷移也密切相關(guān)，如Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)NPM1能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞侵襲遷移。本研究功能分析結(jié)果顯示，喉癌預(yù)后相關(guān)蛋白激酶主要參與細(xì)胞黏附及細(xì)胞遷移正性調(diào)控等細(xì)胞生物學(xué)行為，提示喉癌預(yù)后相關(guān)蛋白激酶可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞黏附及遷移能力影響喉癌患者的預(yù)后。

目前，TNM分期是臨床上預(yù)測(cè)喉癌患者預(yù)后最主要的方法，但仍存在較大預(yù)測(cè)差異[25]。本研究基于預(yù)后相關(guān)蛋白激酶，利用LASSO回歸等方法建立了喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，其ROC曲線在確診后3年的預(yù)后預(yù)測(cè)能力持續(xù)升高，在第3年的預(yù)后預(yù)測(cè)AUC超過(guò)0.8，提示這一模型具有很強(qiáng)的預(yù)后預(yù)測(cè)特異度和敏感度，未來(lái)可為喉癌的臨床診療及預(yù)后預(yù)測(cè)提供新的切入點(diǎn)。