魏 萌，張英民，康少英，李建偉，王振興，陳 偉

(邯鄲市中心醫(yī)院骨三科，河北 邯鄲 056001)

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性致殘性關(guān)節(jié)疾病，臨床癥狀為關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)僵硬、關(guān)節(jié)功能障礙等[1]。有研究顯示，骨關(guān)節(jié)炎在肥胖、中老年、超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)人群中發(fā)病率較高，且多見于女性[2]。目前臨床治療此病多采取藥物治療，但療效不佳，故尋找更好的替代療法成為了亟需解決的問題[3]。微小RNAs(miRNAs)是一種單鏈內(nèi)源性表達(dá)的、較小的非編碼RNA，廣泛存在于動(dòng)植物及病毒中[4]。miRNAs在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，且具有治療疾病的潛力[5-6]。miR-142-3p是調(diào)節(jié)炎癥通路的新因子，可抑制軟骨細(xì)胞的凋亡[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)異常[8]，而其異常表達(dá)可能為骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷和治療提供幫助。由于骨關(guān)節(jié)炎患者較高的致殘率，早期診斷和后期干預(yù)治療具有重要意義。miR-142-3p有望成為較理想的骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)標(biāo)志物，但是目前關(guān)于miR-142-3p如何干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制及其參與的信號(hào)通路尚不清楚。故本研究建立骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，通過調(diào)控miR-142-3p的表達(dá)，探究其對(duì)骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的干預(yù)作用，以期為骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷、疾病監(jiān)測和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

研究動(dòng)物：60只SPF級(jí)健康雄性大鼠，由四川省疾病預(yù)防控制中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(川)2020-229]，鼠齡7～8周，平均(7.63±0.65)周；體質(zhì)量217～249 g，平均(232.29±21.07)g。所有大鼠均于室溫(22～24)℃、濕度40%～70%、自然光照及通風(fēng)、無病原菌的干凈籠子中飼養(yǎng)，水和食物均經(jīng)消毒，按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，允許自由活動(dòng)，飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：HD-DWLL-2019-023)。

主要試劑：miR-142-3p mimic和miR-142-3p inhibitor由南通百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成；白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自杭州鉑賽生物科技有限公司(批號(hào)：BSH2021351A)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒購自上海韻泰信息科技有限公司(批號(hào)：YT202110831)；小鼠抗大鼠蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immune globulin binding protein,Bip)抗體購自上海西格生物科技有限公司(批號(hào)：XGK202145、XGK202157)；小鼠抗大鼠Caspase-9抗體購自武漢益普生物科技有限公司(批號(hào)：ATA25899-53)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組 在60只大鼠中隨機(jī)挑選15只作為空白組(空白組自然生長不做處理)，其余45只大鼠采用前交叉韌帶橫斷術(shù)誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生，建立骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型：在全身麻醉下作內(nèi)側(cè)髕旁切口，將髕骨脫位，露出右膝關(guān)節(jié)，采用顯微剪刀切斷前交叉韌帶，進(jìn)行前抽屜試驗(yàn)以確保切斷成功，復(fù)位髕骨后，依次縫合關(guān)節(jié)囊和皮膚，術(shù)后大鼠置于可自由活動(dòng)的籠子中。建模過程中脫失6只，前抽屜試驗(yàn)呈陰性，剩余39只大鼠進(jìn)行前抽屜試驗(yàn)均呈陽性，最終39只大鼠建模成功，隨機(jī)分為模型組、下調(diào)組、上調(diào)組，每組13只。上調(diào)組大鼠膝部注射miR-142-3p mimic，下調(diào)組大鼠尾部注射miR-142-3p inhibitor，劑量均為100 ng/mg?？瞻捉M、模型組大鼠膝部注射等劑量生理鹽水。

1.2.2 miR-142-3p轉(zhuǎn)染效率鑒定 在miR-142-3p轉(zhuǎn)染完成24 h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-142-3p的轉(zhuǎn)染效率，每組隨機(jī)選取5只大鼠，使用6%水合氯醛(6 mL/kg)腹腔麻醉后處死，取膝關(guān)節(jié)軟骨組織并提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以U6為內(nèi)參，miR-142-3p上游序列：5’-CGCCGTGTAGTGTTTCCTAC-3’，下游序列：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3 HE染色 采用6%水合氯醛(6 mL/kg)腹腔麻醉各組大鼠，在右膝處切開皮膚，分離皮下筋膜組織，取其右側(cè)膝關(guān)節(jié)新鮮軟骨組織，以生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛固定，采用HE試劑盒對(duì)各組大鼠的右側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織樣本進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)變化。

1.2.4 膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度、壓痛閾值、熱痛閾值檢測 觀察并比較各組大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度，其中空白組10只，模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各8只，采用YLS-3E電子壓痛儀測定各組大鼠壓痛閾值，采用足底熱痛測試儀測定大鼠兩側(cè)足后趾熱痛閾值，以大鼠疼痛后嘶鳴作為痛閾指標(biāo)，壓痛閾值、熱痛閾值均測定3次，每次間隔5～10 min，取均值。

1.2.5 ELISA檢測 采集各組大鼠腹動(dòng)脈血2 mL，離心分離血清，參照IL-1β、TNF-α的ELISA試劑盒說明書吸取上清液進(jìn)行加樣及后續(xù)操作。實(shí)驗(yàn)步驟：制作標(biāo)準(zhǔn)品，按照梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；對(duì)應(yīng)板孔中加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品工作液或樣本，37 ℃孵育2 h后立即加入100 μL生物素化抗體工作液；反應(yīng)板洗滌3次，每孔加抗體工作液100 μL，35 ℃溫育45 min；將100 μL TMB溶液加入反應(yīng)孔，35 ℃反應(yīng)45 min，加入終止液，采用酶標(biāo)儀檢測上述指標(biāo)水平(顏色深淺與上述指標(biāo)水平成正比)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 待測血清采用Trizol法進(jìn)行總RNA提取，并使用核酸蛋白檢測儀進(jìn)行濃度檢測；逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR，依次加入Mix 10 mL、上游引物1 mL、下游引物1 mL、RNAase free水7 mL、cDNA 1 mL，每管20 mL。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)上游引物：5’-TGCACCGCAACAACGCAATCT-3’，下游引物：5’-TTCTGGCACTGCTTCCCGAATG-3’；Ⅰ型膠原α1(collagen type Ⅰ α1，COL1α1)上游引物：5’-TTGGTCCTGCTGGCAAGAATGG-3’，下游引物：5’-TCTGTCACCTTGTTCGCCTGTC-3’；金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)上游引物：5’-TGTTTCCCTGTTCAGCCATCCC-3’，下游引物：5’-GGTAGCCCTTCTCAGAGCCCAT-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-AGGTTGTCTCCTGTGACTTCAA-3’，下游引物：5’-CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG-3’。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸6 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算TGF-β、COL1α1、TIMP1的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot 在各組膝軟骨組織研磨勻漿樣本中加入蛋白提取液提取總蛋白，采用BCA法對(duì)PERK/Bip信號(hào)通路蛋白進(jìn)行定量檢測，取10 μL蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，加入適量一抗(兔源PERK、Bip、Caspase-9)封閉，4 ℃過夜孵育，TBST洗滌標(biāo)本，加入適量二抗(羊抗兔IgG)室溫孵育1 h，各組標(biāo)本洗膜，加入等體積化學(xué)發(fā)光液A液、B液與PAGE膜反應(yīng)，曝光顯影，內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率鑒定

與空白組相比，其他各組大鼠miR-142-3p表達(dá)量較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組miR-142-3p表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和下調(diào)組比較，上調(diào)組miR-142-3p表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-142-3p轉(zhuǎn)染成功，見表1。

表1 轉(zhuǎn)染效率鑒定

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)觀察

空白組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織清晰、完整；模型組、下調(diào)組大鼠軟骨退變，軟骨面減少，正常軟骨結(jié)構(gòu)喪失；上調(diào)組大鼠軟骨形態(tài)、結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)，見圖1。

a：空白組；b：模型組；c:下調(diào)組；d：上調(diào)組

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度、壓痛閾值、熱痛閾值比較

與空白組比較，其他各組大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度較小，壓痛閾值、熱痛閾值較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，下調(diào)組大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度較小，壓痛閾值、熱痛閾值較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和下調(diào)組比較，上調(diào)組大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度較大，壓痛閾值、熱痛閾值較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度、壓痛閾值、熱痛閾值比較

2.4 各組大鼠炎癥因子水平比較

與空白組比較，其他各組大鼠IL-1β、TNF-α水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，下調(diào)組大鼠IL-1β、TNF-α水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和下調(diào)組比較，上調(diào)組大鼠IL-1β、TNF-α水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較

2.5 各組大鼠滑膜纖維化標(biāo)志物mRNA比較

與空白組比較，其他各組大鼠TGF-β、COL1α1、TIMP1 mRNA水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，下調(diào)組大鼠TGF-β、COL1α1、TIMP1 mRNA水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和下調(diào)組比較，上調(diào)組大鼠TGF-β、COL1α1、TIMP1 mRNA水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠滑膜纖維化標(biāo)志物mRNA比較

2.6 各組大鼠PERK/Bip信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，其他各組大鼠PERK、Bip、Caspase-9蛋白表達(dá)較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，下調(diào)組大鼠PERK、Bip、Caspase-9蛋白表達(dá)較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和下調(diào)組比較，上調(diào)組大鼠PERK、Bip、Caspase-9蛋白表達(dá)較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5、圖2。

表5 各組大鼠PERK/Bip信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

圖2 PERK/Bip信號(hào)通路蛋白

3 討論

目前對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚無統(tǒng)一定論，有研究認(rèn)為其發(fā)病可能與某些基因表達(dá)調(diào)控紊亂密切相關(guān)，其中miRNAs在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病及進(jìn)展中所起到的關(guān)鍵作用被廣泛接受[9-10]。研究顯示，miR-9-5p、miR-424-59在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中表達(dá)異常，miRNAs可能作為一種調(diào)控基因在骨關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)展過程中起作用，在骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷及治療中具有重要意義[11-12]。有研究顯示，過表達(dá)miR-142-3p可抑制IL-1、IL-6等水平，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，其可作為治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在分子靶點(diǎn)[13]。也有研究顯示，miR-142-3p在關(guān)節(jié)炎患者中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-142-3p的表達(dá)可降低成纖維樣滑膜細(xì)胞活性，促進(jìn)其凋亡，從而改善滑膜細(xì)胞功能，促進(jìn)病情恢復(fù)[14]。本研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠中，上調(diào)miR-142-3p表達(dá)可增加大鼠膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度，提高壓痛閾值、熱痛閾值，并降低炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)水平，從而減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)。

臨床實(shí)踐證實(shí)，TGF-β是轉(zhuǎn)化生長因子超家族的多功能細(xì)胞因子，其主要功能是調(diào)節(jié)炎癥過程，在軟骨的形成、維持、修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用；COL1α1可直接參與Ⅰ型膠原蛋白的合成，在組織纖維化、韌帶損傷、軟骨破壞等多種病理過程中起關(guān)鍵作用；TIMP1是基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑家族主要成員之一，可維持軟骨結(jié)構(gòu)完整[15-17]。張力等[18]的研究顯示，膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠使用膝痹寧治療后，TGF-β、COL1α1、TIMP1水平較低，可能是由于膝痹寧可有效減輕膝骨關(guān)節(jié)滑膜纖維化，從而改善膝關(guān)節(jié)功能[16]。在本研究中，上調(diào)miR-142-3p可有效抑制滑膜組織中TGF-β、COL1α1、TIMP1表達(dá)，緩解滑膜組織纖維化，從而有利于疾病恢復(fù)。

PERK/Bip信號(hào)通路是經(jīng)典的信號(hào)通路之一，其中PERK、Bip、Caspase-9為該通路常見因子[19]。PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，炎癥因子IL-1β、TNF-α異常升高會(huì)活化PERK，PERK活化后會(huì)促使Bip的激活態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致PERK/Bip信號(hào)通路及Caspase-9被激活，而活化的Caspase-9可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，導(dǎo)致軟骨退變[20]。有研究顯示，在骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠中，PERK、Bip蛋白表達(dá)量升高，從而誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)、激活PERK/Bip信號(hào)通路，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變，進(jìn)而造成骨關(guān)節(jié)炎[21]。還有研究顯示，使用中藥治療骨關(guān)節(jié)炎可抑制PERK/Bip、Wnt/β-catenin等信號(hào)通路及IL-4、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，調(diào)控軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，從而減輕軟骨組織損傷[22]。PERK/Bip信號(hào)通路在骨關(guān)節(jié)炎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)引起軟骨細(xì)胞凋亡過程中起重要的調(diào)控作用。在應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時(shí)，Bip蛋白使PERK胞漿區(qū)的蛋白激酶活化，進(jìn)一步磷酸化elF-2α，導(dǎo)致異常蛋白產(chǎn)生減少，并高表達(dá)Bip等分子伴侶，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，阻止軟骨細(xì)胞凋亡和軟骨退變[23-24]。在本研究中，上調(diào)miR-142-3p可以抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)；下調(diào)miR-142-3p可以提高炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)，從而活化PERK蛋白激活Bip信號(hào)通路；因此，上調(diào)miR-142-3p可能通過降低PERK、Bip、Caspase-9蛋白表達(dá)抑制PERK/Bip信號(hào)通路，減輕骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷，改善其臨床癥狀，提示PERK/Bip信號(hào)通路是治療骨關(guān)節(jié)炎的一個(gè)作用靶點(diǎn)。

綜上所述，上調(diào)miR-142-3p可明顯抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠PERK、Bip、Caspase-9蛋白表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，改善膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度，提高壓痛閾值、熱痛閾值，修復(fù)膝關(guān)節(jié)組織損傷，其作用機(jī)制可能與抑制PERK/Bip信號(hào)通路活性相關(guān)，為臨床骨關(guān)節(jié)炎的診治提供了新思路。但目前尚無研究闡明miR-142-3p、PERK/Bip信號(hào)通路與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。