羅 燕，鄧 平，陳夢妍，謝 佳，田 麗，梁譯丹，皮會豐

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍隊勞動衛(wèi)生學(xué)教研室/電磁輻射醫(yī)學(xué)防護教育部重點實驗室，重慶 400038)

鎘(cadmium，Cd)是一種廣泛存在于環(huán)境中的重金屬污染物，半衰期很長，在人體中的生物半衰期為10～30年[1]。鎘通過食物、空氣、水等途徑被人體攝入后會累積于腎、肝、骨骼等組織器官中，誘導(dǎo)腎、肝、神經(jīng)元等多種器官和組織的損傷[2]。腎是鎘暴露和毒性的主要靶器官，機體攝入的鎘有近50%蓄積在腎[3]，尤其是腎皮質(zhì)和近端小管，從而導(dǎo)致腎出現(xiàn)不可逆的病理改變[4]。臨床上，慢性鎘中毒患者可出現(xiàn)糖尿或者蛋白尿，甚至發(fā)展成慢性腎疾病[5]。

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)可用于化學(xué)元素的分析檢測，尤其對金屬元素的分析較為精確。Egger等[6]利用ICP-MS測定了4名人體器官捐獻者的40個不同組織中的鎘濃度，發(fā)現(xiàn)鎘除了在腎、骨骼和肝中沉積外，在肌肉和脂肪組織中亦有分布。ICP-MS被認為是在組織學(xué)水平上闡明鎘毒性的有力工具。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，鎘致腎毒性的主要機制有：活性氧堆積、線粒體應(yīng)激、鈣代謝紊亂、細胞凋亡等[7-9]。然而，鎘在動物或人體組織、器官中的分布情況仍不清楚，且鎘的腎毒性分子機制尚不十分明確。故本研究通過構(gòu)建慢性鎘暴露小鼠模型，監(jiān)測小鼠體質(zhì)量增長情況，利用ICP-MS檢測小鼠肝、腎、腦組織中的鎘含量，并進一步研究小鼠腎組織氧化應(yīng)激指標和凋亡相關(guān)蛋白表達水平的變化，以期對慢性鎘暴露小鼠的器官毒性進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要試劑

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，45只，7周齡，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)20170002，使用許可證號：SYXK(渝)20170002]；所有動物實驗的開展均獲得陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物倫理審查委員會批準(批準號：AMUWEC20224998)。

氯化鎘(CdCl2)粉末(Sigma-Aldrich，美國)；丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)；兔抗小鼠cleaved Caspase-3抗體、兔抗小鼠Bax抗體(Affinity Biosciences，美國)；小鼠抗小鼠Bcl-2抗體(Invitrogen，美國)；小鼠抗小鼠β-actin抗體(CST，美國)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物科技研究所，上海)。ICP-MS Nexion 2000P(鉑金埃爾默企業(yè)管理有限公司，上海)。

1.2 構(gòu)建慢性鎘暴露小鼠模型

雄性C57BL/6J小鼠45只，在SPF級屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度為25 ℃，自由飲水及進食12個月。小鼠被隨機分為對照組、低濃度組和高濃度組，每組15只。對照組正常飲水，低濃度組用低濃度鎘水(0.6 mg/L CdCl2)喂養(yǎng)，高濃度組用高濃度鎘水(3.6 mg/L CdCl2)喂養(yǎng)。實驗過程中對照組和高濃度組各死亡1只，故最終對照組和高濃度組入組數(shù)為14只。

1.3 監(jiān)測小鼠體質(zhì)量增長情況

測量并記錄7周齡小鼠的體質(zhì)量，作為初始體質(zhì)量，以后每周測量1次小鼠體質(zhì)量至小鼠20周齡。

1.4 ICP-MS檢測小鼠肝、腎和腦組織鎘含量

小鼠慢性鎘暴露12個月后，以25%烏拉坦5 mL/kg腹腔麻醉，生理鹽水心臟灌注至左心耳流出澄清液體，取肝、腎和腦組織(每個組織6～8個樣本)，于液氮罐中臨時保存。取材完畢后所有組織標本放于-80 ℃冰箱保存。干冰運送至上海鉑金埃爾默企業(yè)管理有限公司，采用ICP-MS檢測肝、腎、腦組織中鎘含量。

1.5 試劑盒檢測腎組織MDA含量、SOD活力值和GSH-Px活力值

準確稱取小鼠腎組織體質(zhì)量，按體質(zhì)量(mg)∶體積(μL)=1∶9的比例加入9倍體積的勻漿介質(zhì)(0.9%生理鹽水)。冰水浴條件下機械勻漿，制備成10%的勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液為待測樣品。用標準品制作標準曲線，算出待測樣品蛋白濃度(mg/mL)。

1.5.1 MDA含量測定 按照表1依次向空白管、標準管、對照管和測定管中加入試劑，混勻，試管口用保鮮膜扎緊并扎1個小孔，95 ℃沸水浴40 min。流水冷卻，4 000 r/min離心10 min，于波長532 nm處測吸光度(optical density，OD)值。計算公式：MDA含量(nmol/mg)=(測定管OD值-對照管OD值)/(標準管OD值-空白管OD值)×標準品濃度(10 nmol/mL)/待測樣品蛋白濃度(mg/mL)。

表1 MDA試劑盒操作表(mL)

1.5.2 SOD活力值測定 按照表2依次向?qū)φ展芎蜏y定管中加入試劑一、二、三、四，待測樣品，蒸餾水，混勻，37 ℃恒溫水浴40 min。隨后加入顯色劑，靜置10 min后進行顯色反應(yīng)，于波長550 nm處測OD值。計算公式：SOD活力值(U·mg-1)=(對照管OD值-測定管OD值)/對照管OD值/50%×反應(yīng)液總體積(3.31 mL)/取樣量(0.01 mL)/待測樣品蛋白濃度(mg/mL)。每1 mg腎組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位(U·mg-1)。

表2 SOD試劑盒操作表(mL)

1.5.3 GSH-Px活力值測定 按照表3向?qū)φ展芎蜏y定管中加入GSH標準液和待測樣品，混勻，37 ℃水浴預(yù)溫5 min。隨后加入試劑一，混勻，37 ℃水浴酶促反應(yīng)5 min。再加入試劑二和待測樣品，4 000 r/min離心10 min。對照管和測定管各取上清液1 mL進行顯色反應(yīng)。按照表4向空白管、標準管、對照管和測定管中加入試劑進行顯色反應(yīng)，混勻，室溫靜置15 min，于波長412 nm處測OD值。計算公式：GSH-Px活力值(U·mg-1)=(對照管OD值-測定管OD值)/(標準管OD值-空白管OD值)×標準管濃度(20 μmol/L)×稀釋倍數(shù)(5)/反應(yīng)時間(5 min)/(取樣量×待測樣品蛋白濃度)。每1 mg蛋白每分鐘扣除非酶促反應(yīng)的作用使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為1個酶活力單位(U·mg-1)。

表3 GSH-Px試劑盒酶促反應(yīng)操作表(mL)

表4 GSH-Px試劑盒顯色反應(yīng)操作表(mL)

1.6 Western blot檢測腎組織cleaved Caspase-3、Bcl-2/Bax蛋白相對表達量

準確稱取小鼠腎組織質(zhì)量，每100 mg腎組織中加入RIPA裂解液(含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)0.1 mL，最大程度研磨后于冰上裂解25 min。隨后20 000×g，4 ℃離心25 min，取上清液，標準蛋白法測定蛋白濃度。蛋白樣品煮沸變性(99 ℃，15 min)后，-80 ℃分裝保存。

12%預(yù)制膠，每孔20 μg上樣。恒壓80 V SDS電泳2 h。將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyviny-lidene fluoride，PVDF)膜上，恒流250 mA電轉(zhuǎn)1 h。加入快速封閉液室溫封閉20 min。加入小鼠抗小鼠β-actin抗體(1∶1 000)、小鼠抗小鼠Bcl-2抗體(1∶500)、兔抗小鼠Bax抗體(1∶1 000)、兔抗小鼠cleaved Caspase-3抗體(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗脫3次，每次10 min，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG或兔抗小鼠IgG(1∶5 000)，室溫搖床孵育1 h，TBST洗脫3次，每次10 min，加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，在Image lab凝膠成像系統(tǒng)中曝光。采用Image lab軟件分析條帶灰度值，并計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin灰度比值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量情況

各組小鼠7周齡的初始體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，各組小鼠7～20周齡的體質(zhì)量增長情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。各組小鼠7～20周齡體質(zhì)量增長曲線見圖1。

表5 小鼠初始體質(zhì)量和體質(zhì)量增長情況(g)

a：對照組和低濃度組小鼠體質(zhì)量增長曲線；b：對照組和高濃度組小鼠體質(zhì)量增長曲線

2.2 低濃度組和高濃度組小鼠肝、腎、腦組織鎘含量及鎘分布

慢性鎘暴露12個月后，低濃度組和高濃度組小鼠肝、腎、腦組織中均檢測到鎘分布，且腎組織中鎘含量最高，見表6、圖2。

表6 低濃度組和高濃度組小鼠肝、腎、腦組織鎘含量(μg/kg)

圖2 低濃度組和高濃度組小鼠肝、腎、腦組織鎘分布情況

2.3 各組小鼠腎組織MDA含量、SOD活力值和GSH-Px活力值

低濃度組MDA含量、SOD活力值、GSH-Px活力值與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高濃度組MDA含量與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高濃度組SOD活力值、GSH-Px活力值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

a：小鼠腎組織MDA含量；b：小鼠腎組織SOD活力值；c：小鼠腎組織GSH-Px活力值 *：與對照組比較，P<0.05

2.4 各組小鼠腎組織cleaved Caspase-3、Bcl-2/Bax蛋白表達水平

Western blot檢測顯示，低濃度組和對照組比較，高濃度組和對照組比較，小鼠腎組織cleaved Caspase-3/β-actin、Bcl-2/Bax蛋白相對表達量(灰度值比值)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

a：各組小鼠腎組織目的蛋白(cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax)和內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶；b、c：各組小鼠腎組織cleaved Caspase-3/β-actin、Bcl-2/Bax蛋白相對表達量(灰度值比值)

3 討論

鎘是一種具有致癌、致畸、致突變作用的重金屬污染物。根據(jù)之前的研究，攝入過量的鎘會導(dǎo)致生物體腎、肝、骨骼、神經(jīng)、呼吸以及生殖等多個器官和系統(tǒng)損傷[10]。其中，腎是慢性鎘中毒的主要靶器官之一，大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露與慢性腎疾病之間存在強烈關(guān)聯(lián)[11]。

然而，鎘暴露的劑量不同，產(chǎn)生的效應(yīng)也不完全相同[12]。為探索合適的鎘暴露劑量，本研究進行了預(yù)實驗，得出半數(shù)致死劑量(median lethal dose，LD50)為105.6 mg/kg，因此采用1/720×LD50為低濃度組暴露劑量，即鎘水濃度為0.6 mg/L，采用1/120×LD50為高濃度組暴露劑量，即鎘水濃度為3.6 mg/L，與Zhang等[13]的研究結(jié)果一致。本研究中小鼠暴露時間為12個月，僅監(jiān)測小鼠7～20周齡體質(zhì)量增長情況是因為鎘暴露3個月后，小鼠體質(zhì)量趨于穩(wěn)定，故沒有繼續(xù)監(jiān)測。

鎘通過飲食飲水或者皮膚接觸進入生物體后，與金屬硫蛋白(metallothionein，MT)結(jié)合，形成鎘—金屬硫蛋白復(fù)合物(Cd-MT)。Cd-MT通過血液到達腎，并在腎中沉積，主要損害腎小管和腎皮質(zhì)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，鎘進入小鼠體內(nèi)后，主要蓄積在腎，與文獻報道結(jié)果一致[14-15]。值得注意的是，鎘在各器官的分布還取決于暴露時間，急性暴露后，鎘主要富集于肝[16-17]，與本實驗的慢性暴露有所不同。

氧化應(yīng)激是鎘致腎毒性的主要機制之一。在正常生理情況下，機體有一套完整的抗氧化酶系統(tǒng)以抵御氧自由基損傷。SOD是其中一種重要的抗氧化酶，能夠?qū)⒀踝杂苫缁癁檫^氧化氫，并進一步在GSH-Px的作用下轉(zhuǎn)化為水，從而達到清除過量氧自由基的目的。研究表明，在慢性鎘暴露造成腎損傷的過程中，氧自由基大量生成，而SOD和GSH-Px等酶活性受抑制，未被清除的氧自由基持續(xù)攻擊細胞膜脂質(zhì)，出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成終產(chǎn)物MDA的堆積，因此，MDA含量可間接反映機體受氧自由基攻擊的程度[18]。Renugadevi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CdCl25 mg/kg處理4周后，大鼠血清尿素、尿酸和肌酐水平明顯升高，肌酐清除率顯著降低，尿中尿素、尿酸和肌酐的含量明顯降低，提示腎功能損傷；進一步研究發(fā)現(xiàn)大鼠腎組織脂質(zhì)過氧化指標MDA升高，抗氧化酶SOD、GSH-Px及過氧化氫酶CAT顯著降低，大鼠腎小管壞死變性，基底膜增厚、管腔鑄型形成，提示氧化應(yīng)激參與了腎損傷過程。本研究結(jié)果亦顯示，低濃度組和高濃度組小鼠腎組織MDA均升高，提示存在脂質(zhì)過氧化損傷；然而，低濃度組小鼠腎組織抗氧化酶SOD和GSH-Px亦被激活，推測可能是由于低濃度鎘暴露后小鼠腎組織尚有一定的代償能力，而高濃度組小鼠由于鎘暴露劑量大，持續(xù)時間長，已無法檢測到抗氧化酶系統(tǒng)的激活。

鎘引起的腎毒性還與鎘誘導(dǎo)的凋亡通路激活有關(guān)。Caspase-3是白細胞介素1β轉(zhuǎn)化酶家族成員之一，在細胞凋亡過程中占據(jù)重要地位。正常情況下，胞質(zhì)中的Caspase-3以無活性的酶原(pro-Caspase-3)形式存在，當?shù)蛲鲂盘柾繁患せ顣r，在多種蛋白水解酶作用下，pro-Caspase-3發(fā)生裂解而活化。活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表達水平與Caspase-3的活性呈正相關(guān)。Bcl-2是第一個被確認的能對抗細胞凋亡的基因，其中Bcl-2α是抑制凋亡的主要蛋白。促凋亡基因編碼的Bax與Bcl-2對抗，可阻止Bcl-2α抗凋亡作用的發(fā)揮，通常Bcl-2/Bax比值下降反映凋亡通路的激活。Mao等[20]發(fā)現(xiàn)HEK-293細胞在30～60 μmol/L CdCl2作用下Bax表達增加，Bcl-2表達下降，Caspase-3活性增強，預(yù)處理轉(zhuǎn)染pcDNA3/Bcl-2質(zhì)粒后，這些現(xiàn)象均得到緩解。Prozialeck等[21]研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠給予鎘處理6周后，其腎小管細胞出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，尿液中腎損傷分子-1、GSH-Px、乳酸脫氫酶顯著增高。Li等[22]認為鎘通過電壓依賴性鈣通道進入細胞，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放，進而誘導(dǎo)DNA碎片化和細胞凋亡；另一方面，鎘可能激活Caspase-8，進而激活Caspase-3誘導(dǎo)細胞凋亡，但是這種情況往往發(fā)生于急性鎘暴露的情形。另有研究表明，鎘暴露的細胞中只有一小部分死于凋亡，其余的細胞則可能成為抗凋亡細胞，而鎘轉(zhuǎn)化或鎘適應(yīng)細胞反而增加了對凋亡的抵抗，更容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化[23]。事實上，凋亡的破壞被認為是腫瘤形成和惡性進展的關(guān)鍵[24]。本研究未檢測到低濃度組和高濃度組慢性鎘暴露小鼠中cleaved Caspase-3蛋白的激活，Bcl-2/Bax相對表達量和對照組比較亦沒有顯著差異。推測可能是由于暴露時間較長，慢性鎘暴露小鼠腎組織出現(xiàn)了代償，或者小鼠腎組織已出現(xiàn)壞死或腫瘤轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致無法檢測到凋亡蛋白的激活。本研究的局限性在于未能及時對小鼠腎組織進行病理切片觀察，故缺少腎損傷的病理學(xué)證據(jù)支持，并且沒有進一步在動物或者細胞水平上進行氧化應(yīng)激或者凋亡的機制研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，對于慢性鎘暴露的小鼠，鎘主要蓄積在腎，并誘導(dǎo)腎組織氧化應(yīng)激改變，造成組織損傷。研究表明，減輕氧化應(yīng)激可緩解鎘的腎毒性[25-26]，若能將防治鎘致腎毒性的藥物運用到臨床治療上，對于保護人類健康具有重要的現(xiàn)實意義。