黃旭陽(yáng)，王舒涵，韓 冬，李潤(rùn)輝

0 引言

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病之一。2011年全國(guó)部分省市調(diào)查結(jié)果顯示，SCI發(fā)病率為23.7～60.6/100 000[1]，其主要原因?yàn)闄C(jī)動(dòng)車(chē)事故(40.0%)或高空墜落(37.8%)[2]。SCI后常導(dǎo)致?lián)p傷組織的細(xì)胞凋亡等病理生理反應(yīng)發(fā)生紊亂，從而嚴(yán)重影響脊髓相應(yīng)節(jié)段神經(jīng)束傳導(dǎo)功能，進(jìn)而導(dǎo)致患者發(fā)生肢體麻木與癱瘓[3-5]。因此，尋找一條有效的途徑來(lái)降低SCI后細(xì)胞凋亡水平至關(guān)重要。Wnt信號(hào)通路與多種神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生的病理生理過(guò)程密切相關(guān)，如神經(jīng)退行性病變、神經(jīng)炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等。研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以抑制由脊髓損傷引起的神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能恢復(fù)[6]。追風(fēng)透骨膠囊(Zhuifengtougu capsule，ZFTG)是由川烏總堿、天麻等24種藥材制成的中成藥，主要有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、鎮(zhèn)痛祛寒等作用。臨床上主要應(yīng)用于神經(jīng)麻痹、手足麻痹、風(fēng)寒濕痹、四肢痹痛等癥狀[7-8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，追風(fēng)透骨膠囊所含有的川烏總堿、蚯蚓素、天麻素、川芎嗪等多種活性物質(zhì)可能與抗神經(jīng)損傷有密切關(guān)系[7,9-10]。前期研究發(fā)現(xiàn)，ZFTG可以有效地激活Wnt/β-cantein信號(hào)通路并減少細(xì)胞凋亡。因此，本實(shí)驗(yàn)擬探討追風(fēng)透骨膠囊對(duì)SCI模型大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠45只，8～10周齡，體重240～260 g。由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(遼)2014-0004。

1.1.2 藥物 將追風(fēng)透骨膠囊(湖南天地恒一)內(nèi)粉末研碎至于PBS中，加熱并超聲波震蕩溶解，溶解后4 ℃保存。

1.1.3 主要試劑與儀器 主要試劑：β-catenin抗體(Abcam公司)，LRP-6抗體(Abcam公司)，active Caspase-3抗體(Cell signaling公司)等。主要儀器：Biorad雙向電泳儀、通用電泳儀、大型水平、小型垂直電泳槽，Leica組織自動(dòng)包埋機(jī)、冰凍切片機(jī)，Nanodrop ND2000檢測(cè)儀和Tecan酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為Sham組(假手術(shù)組)、Vehicle組(脊髓損傷組)、ZFTG組(治療組，20 mg/kg，濃度由人體用藥濃度換算)，每組15只。實(shí)驗(yàn)大鼠用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，進(jìn)行備皮-消毒-鋪單工作。Sham組只切開(kāi)脊髓最高點(diǎn)的皮膚，鈍性分離組織并破壞椎板(相當(dāng)于T10節(jié)段)，但是不損傷脊髓組織。Vehicle組在Sham組的基礎(chǔ)上，應(yīng)用經(jīng)典的Allen′s法(用脊髓打擊器打擊脊髓)制造SCI模型后，注射與ZFTG組相應(yīng)劑量的PBS溶液。ZFTG組在Vehicle組的基礎(chǔ)上，腹腔注射已經(jīng)配制好的追風(fēng)透骨膠囊溶液。術(shù)后飼養(yǎng)于SPF級(jí)鼠房，每天喂食喂水并排尿2次。在飼養(yǎng)過(guò)程中，Sham組死亡1只，Vehicle組死亡3只，ZFTG組死亡1只。

1.2.2 大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(BBB評(píng)分) 本實(shí)驗(yàn)采用Basso、Beattie、Bresnahan locomotor rating scale(BBB評(píng)分)評(píng)價(jià)大鼠SCI后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。分別在第2部分實(shí)驗(yàn)術(shù)后第1、3、7、14、28天進(jìn)行評(píng)分。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，BBB評(píng)分是觀察SCI后動(dòng)物的踝、臀、膝關(guān)節(jié)，軀干運(yùn)動(dòng)及其協(xié)調(diào)情況，分?jǐn)?shù)為0分(完全癱瘓)～21分(脊髓未受損傷)。所有BBB評(píng)分的工作均由4名有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)者用雙盲的實(shí)驗(yàn)方法共同完成。

1.2.3 組織準(zhǔn)備與尼式染色 術(shù)后第7天，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，應(yīng)用生理鹽水與4%多聚甲醛(PFA)依次灌流。灌流成功后取脊髓(T8～L2)，放置于4%多聚甲醛中固定。2 d后，用冰凍切片機(jī)切片，每張厚度20 μm(采用單盲法測(cè)量40張切片)，切好后貼在載玻片上，并放入-20 ℃ 冰箱保存，之后在室溫下晾干(30 min)。將切片放入氯仿乙醇(1∶1)中過(guò)夜，次日取出后三蒸水浸泡，洗3遍，放入37 ℃焦油紫中浸泡40 s，放入三蒸水，洗1遍，之后依次放入95%乙醇、無(wú)水乙醇、二甲苯溶液，最后取出后用中性樹(shù)膠封片。靜置1 d后光學(xué)顯微鏡照相檢測(cè)。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 術(shù)后7 d，按上述方式，在冰浴條件下取脊髓組織提蛋白并用BCA法制樣。準(zhǔn)備好樣品后上樣，電泳后轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))、封閉，最后加一抗4 ℃過(guò)夜，第2天加相應(yīng)的二抗。其中一抗分別是β-catenin(1∶1 000)、LRP-6(1∶1 000)、active Caspase-3(1∶800)、β-actin(1∶1 000)。隨后滴加適量的ECL顯色液上機(jī)檢測(cè)，最后用Image J軟件檢測(cè)條帶吸光度(A)值。

2 結(jié)果

2.1 追風(fēng)透骨膠囊對(duì)SCI模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響 術(shù)后分別在第1、3、7、14、28天測(cè)定BBB評(píng)分。Sham組評(píng)分基本穩(wěn)定在21分，ZFTG組與Vehicle組曲線均呈上升趨勢(shì)。但是與Vehicle組比較，ZFTG組的分?jǐn)?shù)分別在損傷后第7、14天升高(P<0.05)，第28天分?jǐn)?shù)明顯升高(P<0.01)，表明追風(fēng)透骨膠囊與SCI模型大鼠的相關(guān)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)有密切聯(lián)系。見(jiàn)圖1。

2.2 追風(fēng)透骨膠囊對(duì)SCI模型大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元含量的影響 術(shù)后第7天，對(duì)切片進(jìn)行尼式染色(神經(jīng)元特異性染色)。結(jié)果顯示，大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)中，與Vehicle組比較，ZFTG組數(shù)量明顯升高(P<0.05)，表明追風(fēng)透骨膠囊可以維持SCI模型大鼠的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的含量。見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠的行為學(xué)檢測(cè)

2.3 追風(fēng)透骨膠囊對(duì)SCI模型大鼠脊髓組織中β-catenin、LRP-6、active Caspase-3蛋白含量的影響 術(shù)后7 d，提取不同分組中大鼠的脊髓蛋白并制樣，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述蛋白的抗體。結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，ZFTG組β-catenin蛋白特異性升高(P<0.01)，LRP-6蛋白表達(dá)被明顯激活(P<0.01)，提示β-catenin信號(hào)通路被激活。active Caspase-3蛋白表達(dá)被明顯抑制(P<0.01)，提示組織凋亡水平下降。見(jiàn)圖3。

3 討論

SCI包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷2個(gè)病理過(guò)程，其中繼發(fā)性損傷在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能恢復(fù)過(guò)程中起重要作用，損傷多由炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞自噬、組織水腫與瘢痕形成等因素引起[11-14]，而神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平的調(diào)控影響SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)進(jìn)程及結(jié)局[15]。但是，目前SCI后神經(jīng)修復(fù)的具體分子機(jī)制尚不明確，因此，尋找SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)的具體分子機(jī)制以及闡述炎癥與凋亡等特異性病理生理變化在SCI后神經(jīng)功能修復(fù)過(guò)程中的作用是SCI領(lǐng)域的一項(xiàng)重大課題。在當(dāng)今醫(yī)學(xué)發(fā)展中，中醫(yī)中藥發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道了追風(fēng)透骨膠囊的有效成分中草烏總堿、川烏總堿、蚯蚓素、天麻苷元等(12種)對(duì)抗炎有獨(dú)特的療效。此外，川芎嗪、天麻素等有效成分可以有效緩解神經(jīng)損傷癥狀(如神經(jīng)麻痹、肢體麻木等)[7-10]。前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，ZFTG可以有效調(diào)節(jié)組織凋亡水平，并且可以緩解神經(jīng)損傷，然而其具體機(jī)制不清。

本課題首次揭示ZFTG調(diào)控SCI后凋亡水平，但ZFTG治療大鼠SCI方面研究較少，缺少可以直接借鑒的藥物濃度，因此，需要尋找一個(gè)有效的藥物濃度。我們根據(jù)ZFTG人體應(yīng)用劑量估算出實(shí)驗(yàn)濃度，并進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。研究表明，動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(BBB評(píng)分)可以宏觀判斷一種干預(yù)手段是否切實(shí)有效，特別是在神經(jīng)損傷與行為認(rèn)知方面[16]，并且本研究中BBB評(píng)分結(jié)果顯示ZFTG組評(píng)分明顯優(yōu)于Vehicle組，充分驗(yàn)證了此濃度下ZFTG可有效促進(jìn)SCI大鼠下肢主要關(guān)節(jié)(髖、膝、踝)運(yùn)動(dòng)功能及其協(xié)調(diào)性的恢復(fù)。由于其行為學(xué)評(píng)分在第7天開(kāi)始出現(xiàn)明顯差異，所以，本課題應(yīng)用術(shù)后第7天大鼠進(jìn)行機(jī)制探究。脊髓組織中負(fù)責(zé)傳遞信號(hào)的細(xì)胞是神經(jīng)元，因此，神經(jīng)元的含量與功能是否正常可以影響脊髓相應(yīng)節(jié)段中神經(jīng)的傳導(dǎo)功能。因此，神經(jīng)元含量可以粗略反映出神經(jīng)傳導(dǎo)是否正常[17]。本研究結(jié)果顯示，在神經(jīng)元特異性尼式染色的結(jié)果中，ZFTG組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量明顯多于Vehicle組，說(shuō)明追風(fēng)透骨膠囊可以增加脊髓內(nèi)神經(jīng)元的含量。因?yàn)榧顾枨敖沁\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元主要支配軀體運(yùn)動(dòng)，所以追風(fēng)透骨膠囊可能與大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)有密切聯(lián)系。

圖2 追風(fēng)透骨膠囊對(duì)脊髓神經(jīng)元含量的影響

圖3 追風(fēng)透骨膠囊對(duì)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡水平的影響及其分子機(jī)制

注：A.Western blot檢測(cè)追風(fēng)透骨膠囊對(duì)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡水平的影響，B.β-catenin/β-actin的定量分析，C.LRP-6/β-actin的定量分析,D.active Caspase-3/β-actin的定量分析。與Vehicle組比較，*P<0.05，**P<0.01

研究表明，神經(jīng)損傷恢復(fù)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等病理生理反應(yīng)，特別是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元的凋亡水平可以直接決定相應(yīng)脊髓節(jié)段神經(jīng)通路是否可以正常傳導(dǎo)[11-14]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的抗凋亡作用，并且此通路激活后，相關(guān)的關(guān)鍵因子LRP-6也會(huì)被特異性激活[6]。本研究表明，術(shù)后第7天，ZFTG組的active Caspase-3蛋白表達(dá)水平被明顯抑制，說(shuō)明追風(fēng)透骨膠囊可以有效減低SCI損傷組織中細(xì)胞凋亡水平。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZFTG組β-catenin、LRP-6蛋白表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明追風(fēng)透骨膠囊通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路降低細(xì)胞凋亡水平。

本研究采用追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)SCI模型大鼠，觀察大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)及其分子機(jī)制。結(jié)果顯示，ZFTG可以增加SCI大鼠模型的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量，這可能與大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)有關(guān)。同時(shí)，追風(fēng)透骨膠囊可以明顯降低損傷脊髓中細(xì)胞凋亡水平，這可能與ZFTG激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。綜上所述，ZFTG可以抑制SCI引起的細(xì)胞凋亡，并可增加脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)廣大脊髓損傷患者損傷神經(jīng)元的修復(fù)，并提高其生活質(zhì)量水平。