陳晶晶， 王英哲， 金 艷， 周 仂， 徐 博*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春130118； 2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春130033)

隨著我國經(jīng)濟(jì)科技的迅猛發(fā)展，環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，而重金屬污染是當(dāng)今面積最廣、危害最大的環(huán)境問題之一，當(dāng)植物體內(nèi)重金屬過量積累或超過臨界值時(shí)，會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝產(chǎn)生消極影響[1-3]。紫花苜蓿(MedicagosativeL.)作為一種優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草，在畜牧業(yè)中有著舉足輕重的地位。重金屬鉛對(duì)紫花苜蓿的污染也是不可避免的，當(dāng)鉛在紫花苜蓿體內(nèi)過量積累時(shí)會(huì)導(dǎo)致鉛在動(dòng)物和人的體內(nèi)富集，從而對(duì)人體產(chǎn)生危害。本試驗(yàn)以不育系MS-GN為母本，14個(gè)不同的父本構(gòu)建的雜交組合F1代種子為材料，研究在不同濃度硝酸鉛溶液處理下的雜交組合F1幼苗的生理指標(biāo)變化，分析鉛脅迫對(duì)生理指標(biāo)產(chǎn)生的影響，以期找到在鉛脅迫下耐受性更強(qiáng)的紫花苜蓿雜交組合，為紫花苜蓿耐鉛品種選育提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本研究以14個(gè)不同品種的紫花苜蓿為父本、不育系MS-GN為母本構(gòu)建的雜交組合F1代為研究材料，供試材料均由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。父本來源見表1。

挑選籽粒飽滿的雜交組合種子播種于盛有滅菌營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，花盆高15 cm，口徑10 cm，每盆播種6粒種子，每個(gè)雜交組合播種18盆。做好標(biāo)記后移至HPG-400HX人工氣候箱培養(yǎng)40天(光照12 000 lx，15 h，溫度25℃、濕度75%；無光照，9 h，溫度20℃、濕度75%)。配制不同濃度(50 mmol·L-1，100 mmol·L-1，150 mmol·L-1，200 mmol·L-1，300 mmol·L-1)的硝酸鉛[Pb(NO3)2]溶液，每個(gè)雜交組合3盆為1組，共分為5個(gè)處理組和1個(gè)對(duì)照組。處理組每盆澆灌5 mL相應(yīng)濃度的Pb(NO3)2溶液，對(duì)照組噴施相同體積的蒸餾水，每3 d處理1次，共處理3次，每次處理后均放回原培養(yǎng)箱培養(yǎng)，9 d后測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)：可溶性蛋白(soluble protein,SP)、可溶性糖(soluble sugar,SS)、丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)、過氧化氫酶(catalase,CAT)。

表1 紫花苜蓿雜交組合父本來源Table 1 The source of alfalfa hybrid combinations

1.2 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.2.1植物組織液的提取 稱取0.1500 g幼苗的新鮮葉片剪碎，加入0.05 mol·L-1，pH=7.8的磷酸緩沖液1.5 ml及少量的石英砂于研缽中研磨，移至2 ml離心管中，5 000 r·min-1，4℃下離心10 min，取上清液，用于指標(biāo)測(cè)定[4]。

1.2.2生理指標(biāo)的測(cè)定 MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[4]，SS含量采用蒽酮比色法測(cè)定[4]，SP含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定，CAT活性采用可見光法測(cè)定[4]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用Excel 2013，SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 綜合評(píng)價(jià)方法

采用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)判[5]。

與耐受性呈正相關(guān)的參數(shù)SP、SS、CAT采用公式1：

(1)

與耐受性呈負(fù)相關(guān)的參數(shù)MDA采用公式2:

(2)

式中：Xijk表示第i個(gè)品種第j個(gè)處理下的第k個(gè)指標(biāo)的測(cè)定值；U(Xijk)表示第i個(gè)品種第j個(gè)處理下的第k個(gè)指標(biāo)的隸屬度，且U(Xijk)∈[0,1]；XMIN，XMAX表示測(cè)定值中的最小值和最大值。

2 結(jié)果

2.1 SP含量的變化

不同濃度硝酸鉛溶液處理下各個(gè)雜交組合幼苗中的SP含量變化結(jié)果如表2所示。

表2 不同處理對(duì)SP含量的影響Table2 Effects of different treatments on soluble protein contents

注：不同字母表示同一雜交組合不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同

Note:Different letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 level,the same as below

2.2 SS含量變化

鉛脅迫處理下各個(gè)雜交組合幼苗中的SS含量變化結(jié)果如表3所示。

2.3 MDA含量的變化

不同濃度硝酸鉛溶液對(duì)雜交組合幼苗處理后的MDA含量變化結(jié)果如表4所示。

表3 不同處理對(duì)SS含量的影響Table 3 Effects of different treatments on soluble sugar contents

表4 不同處理下對(duì)MDA含量的影響Table 4 Effects of different treatments on MDA contents

2.4 CAT活性的變化

本研究結(jié)果表明在經(jīng)過Pb處理后2×M，4×M，5×M，7×M，8×M，11×M，15×M雜交組合CAT活性升高，結(jié)果數(shù)據(jù)見表5。

2.5 綜合評(píng)價(jià)

紫花苜蓿對(duì)重金屬Pb的耐受性與多個(gè)指標(biāo)均相關(guān)，使用隸屬函數(shù)法做綜合評(píng)價(jià)(表6)。各雜交組合的耐受性按大小排序：11×M>8×M>3×M>1×M>7×M>9×M>6×M>2×M>5×M>10×M>4×M>13×M>14×M>12×M。

表6 隸屬函數(shù)值Table 6 Subordinate function values

3 結(jié)論與討論

植物在遇到干旱、寒冷、凍害、鹽堿脅迫時(shí)可通過增加體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御外界不良環(huán)境的影響，以保障自身正常的生長(zhǎng)發(fā)育。同樣的，紫花苜蓿雜交組合的幼苗在吸收了土壤中的鉛后通過積累體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，即可溶性蛋白、可溶性糖以及丙二醛，減輕鉛對(duì)幼苗產(chǎn)生的不良影響。

SP大多以酶的形式參與植物體的代謝過程[6]，測(cè)定SP在鉛脅迫時(shí)含量變化亦可作為了解紫花苜蓿體內(nèi)總代謝的重要指標(biāo)。如表2結(jié)果所示，隨著硝酸鉛溶液濃度的變化SP含量的變化幅度較小，但總體上各雜交組合在不同處理下的SP含量變化呈上升趨勢(shì)，2×M，3×M，5×M，7×M，9×M，10×M，11×M，14×M雜交組合的SP含量在經(jīng)過各個(gè)濃度鉛溶液處理后均有所升高。說明這些雜交組合幼苗在遭受不良環(huán)境的脅迫時(shí)體內(nèi)代謝活動(dòng)旺盛，酶的含量升高。

SS的含量影響植物體內(nèi)總?cè)苜|(zhì)濃度的變化，植物在逆境下積累更多的可溶性糖，增加細(xì)胞濃度，從而增強(qiáng)抗逆性[7]。本研究中，各雜交組合幼苗體內(nèi)可溶性糖的含量經(jīng)過不同濃度的硝酸鉛溶液處理后均高于對(duì)照組，這表明當(dāng)植物遇到外界逆境脅迫時(shí)，會(huì)通過增加體內(nèi)SS含量，增強(qiáng)抗逆性。

MDA是植物在逆境脅迫下對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化水平的一種反應(yīng)[8]。由表3結(jié)果可知，隨著鉛溶液濃度的升高，3×M，4×M，5×M，6×M，7×M，8×M，9×M，11×M，12×M，14×M雜交組合體內(nèi)的MDA均升高，說明此時(shí)幼苗體內(nèi)質(zhì)膜過氧化程度降低。鉛脅迫導(dǎo)致雜交組合幼苗體內(nèi)MDA的積累從而降低了質(zhì)膜過氧化水平，表現(xiàn)出對(duì)重金屬鉛的抗逆性，這與孫剛[9]、王敏[10]的研究結(jié)果一致。

CAT作為重要的酶促清除系統(tǒng)，在清除植物體內(nèi)過氧化氫、維持氧自由基平衡、減輕逆境對(duì)植物的損害等方面具有重要作用[10]。表4結(jié)果表明在經(jīng)過硝酸鉛溶液處理后2×M雜交組合在50 mmol·L-1，100 mmol·L-1，200 mmol·L-1，300 mmol·L-1的硝酸鉛溶液處理下CAT活性顯著高于對(duì)照組，4×M雜交組合在150 mmol·L-1，200 mmol·L-1的硝酸鉛溶液處理下CAT活性顯著高于對(duì)照組，8×M雜交組合CAT含量雖然在150 mmol·L-1，200 mmol·L-1的硝酸鉛溶液處理下有所升高，但增幅不顯著。11×M雜交組合在200 mmol·L-1，300 mmol·L-1處理下的CAT活性升高但不顯著，12×M的CAT活性在150 mmol·L-1的處理下顯著升高。說明經(jīng)過硝酸鉛溶液處理后的幼苗通過增加體內(nèi)CAT活性，加速清除體內(nèi)活性氧，提升自身的抗逆境能力。而其余雜交組合CAT活性卻有所降低，原因可能是由于父本不同，導(dǎo)致雜交組合之間在耐受性存在差異，鉛脅迫可能抑制其余雜交組合體內(nèi)CAT的活性。

綜合14個(gè)雜交組合F1代在不同濃度的硝酸鉛溶液處理后各項(xiàng)生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，求得平均值，按大小排序：11×M>8×M>3×M>1×M>7×M>9×M>6×M>2×M>5×M>10×M>4×M>13×M>14×M>12×M。綜合評(píng)價(jià)的結(jié)果與單一指標(biāo)的結(jié)果略有出入，說明了在評(píng)價(jià)植物耐鉛性時(shí)，不宜選擇單一指標(biāo)作為評(píng)價(jià)依據(jù)，應(yīng)綜合考慮多個(gè)指標(biāo)的共同作用。