呂鑒泉*, 羅諾琳， 謝水勇, 張恒銘

(嘉應學院化學與環(huán)境學院，廣東梅州 514015)

廣東省梅州市蕉嶺縣是國際自然醫(yī)學會認定的世界第七個“世界長壽鄉(xiāng)”(中國第四個“世界長壽鄉(xiāng)”)，長壽現(xiàn)象激起了人們對蕉嶺的人文、自然與生態(tài)環(huán)境、飲食習慣等方面的研究興趣，特別是蕉嶺的富硒環(huán)境對長壽的貢獻。

硒是一種生命體必須的化學元素，既具營養(yǎng)與藥理功能、又有毒理效應[1 - 2]。其功能與效應，一方面取決于硒存在的化學形態(tài)，不同形態(tài)的硒存在差別明顯的毒理、藥理效應[3]；另一方面，還與總硒以及不同硒形態(tài)的濃度水平直接相關，硒的匱乏往往誘發(fā)區(qū)域性疾病，而過量的硒可引起神經(jīng)系統(tǒng)異常乃至死亡[4]。因此，在研究富硒環(huán)境對長壽的貢獻時，硒的存在形態(tài)及其獲取方法、毒(藥)效應及其生物可利用度等方面信息至關重要。目前，就農(nóng)產(chǎn)品中各種硒形態(tài)的提取、分離與檢測技術而言，無機硒的技術較為成熟，而有機硒的技術則因其形態(tài)的多樣性與復雜性尚待在傳統(tǒng)方法的基礎上進一步完善[5]。

本文以蕉嶺境內(nèi)生長周期短[6]、富硒能力強[7]的紫云英為研究對象，采用廣泛使用的溶劑提取、微波消解、氫化物-原子熒光光譜法探討硒的賦予形態(tài)及其變化，以期為總結(jié)蕉嶺生態(tài)地理環(huán)境中硒的轉(zhuǎn)化及其對長壽的貢獻提供基礎信息。

1 實驗部分

1.1 藥品與儀器

硒元素標準溶液(100 μg/mL，中國計量科學研究院)，透析袋(7 000 Da，上海源葉生物科技有限公司)。所用其它藥品均為國產(chǎn)分析純及以上規(guī)格的試劑，實驗用水均為本實驗室自制的超純水。

AFS933原子熒光光度計(北京吉天儀器有限公司)；XH-200A電腦微波固液相合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；XH-2008D型電腦智能溫控低溫超聲波合成萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；TG20-WS高速離心機(鄭州宏朗儀器設備有限公司)；XS-02多功能粉碎機(上海兆申科技有限公司)。

1.2 樣品采集及處理

現(xiàn)蕾期、盛花期和成熟期自然生長的紫云英樣品，分別于3月上旬、4月中旬和5月底采集自廣東省梅州市蕉嶺縣三圳鎮(zhèn)約2平方公里區(qū)域內(nèi)，每期10個點的全草作為樣品，并分別標記為A、B、C。各期的新鮮紫云英棄去雜草、枯葉、泥土和污垢，水洗凈，烘干，粉碎，過100目篩，粉末分別裝入試劑瓶中保存，備用。

1.3 測定方法

1.3.1硒的定量根據(jù)國家標準《食品中硒的測定》(GB 5009.93-2010)，采用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HG-AFS)，按照表1條件測定硒標準溶液的熒光強度，取3次測定的平均值繪制標準曲線。測定樣品時，控制與標準曲線相同的條件，均由熒光強度換算成硒含量。實驗結(jié)果表明，0.07～10.00 μg/L的硒與信號呈現(xiàn)良好的線性關系，響應方程：y=33.13x+1.03，相關系數(shù)(R2)為0.9998。該方法的檢出限為0.0657 μg/L；重復11次測量10 μg/L的硒標準溶液，測量結(jié)果的相對標準偏差為1.05%。

表1 測量條件

1.3.2總硒含量的測定借鑒文獻方法[8]微波消解樣品。具體操作如下：準確稱取0.5 g紫云英粉末于三頸燒瓶中，分別加入5 mL濃HNO3和1 mL 30% H2O2，在120 ℃、800 W功率下微波消解30 min，電爐上加熱至溶液澄清透明，冷卻至室溫，加入HCl(1+4)，轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，定容。取適當體積的消解液用HG-AFS法測定總硒的含量。

1.3.3無機硒含量的測定按照文獻方法[9]，準確稱取紫云英干粉0.5 g，放入研砵中，滴加少許超純水充分濕潤紫云英粉末，在研砵中用力碾磨紫云英粉末以使細胞充分破裂，碾磨后的粉末轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入10 mL超純水，沸水浴中提取30 min，冷卻至室溫，在550 W條件下超聲10 min，溶液在4 000 r/min條件下離心10 min，上清液用HG-AFS法測定無機硒的含量。

1.3.4核酸硒含量的測定借鑒文獻方法[10]，采用濃鹽法提取-微波消解-HG-AFS法測定紫云英中核酸硒的含量。具體操作如下：準確稱取紫云英干粉0.5 g，加入15 mL 12% NaCl溶液，于沸水浴中反應40 min后抽濾，用相同步驟對濾渣重提二次，合并濾液，用10 mL氯仿-正丁醇(4∶1，V/V)除去蛋白質(zhì)后，溶液用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.5，4 ℃靜置12 h，3 000 r/min離心30 min，得核酸沉淀，用95%乙醇多次沖洗沉淀，微波消解沉淀，HG-AFS法測定紫云英中核酸硒。

1.3.5多糖硒含量的測定參考文獻方法[11]，在提取核酸的基礎上，采用草酸法提取-微波消解-HG-AFS法測定紫云英中多糖硒的含量。具體操作如下：向提核酸后的濾渣中加入25 mL 3%的草酸溶液，沸水浴中提取30 min，抽濾，重提二次,合并濾液,用15 mL的氯仿-正丁醇(4∶1，V/V)除去蛋白質(zhì)后,水相加入300 mL 95%乙醇，4 ℃下靜置12 h,3 000 r/min離心30 min,得多糖沉淀,用85%乙醇多次沖洗沉淀，按上述微波消解沉淀、HG-AFS法測定多糖硒。

1.3.6蛋白硒含量的測定參考文獻方法[12]，具體操作如下：準確稱取0.5 g紫云英粉末至燒杯中，加入15 mL 0.1 mol/L KOH溶液，于50～60 ℃水浴中攪拌提取4 h，抽濾，用0.1 mol/L KOH溶液重復2次處理濾渣。合并濾液，加(NH4)2SO4至50%飽和度，4 ℃冰箱中靜置過夜，4 000 r/min下離心15 min，收集沉淀。沉淀用5 mL Tris-HCl溶液(pH=8)溶解，轉(zhuǎn)移至預處理好的透析袋中，純水中透析直至透析液不與10% BaCl2產(chǎn)生白色沉淀。樣品按HG-AFS法測定蛋白硒的含量。

參考文獻方法[13]，具體操作如下：測定水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性硒蛋白含量時，依次用相同體積的水、0.5 mol/L NaCl、75%乙醇溶液和0.1 mol/L KOH為浸提液(代替0.1 mol/L KOH溶液)，除水溶性硒蛋白需要水浴提取外其它硒蛋白均在不加熱條件下提取，分別用少量浸提液溶解沉淀的蛋白質(zhì)，其它操作與蛋白硒所述的相同，用微波消解-HG-AFS法測定對應的蛋白硒含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 總硒、無機硒與有機硒

按照實驗方法測定紫云英中總硒和無機硒，有機硒含量為總硒與無機硒的差值，結(jié)果列于表2。從表中數(shù)據(jù)可以看出：(1)隨著紫云英的生長成熟，其中的總硒含量也隨之增加，從現(xiàn)蕾期到盛花期總硒含量增長了26.7%，從盛花期到成熟期總硒含量增長了50.8%；(2)現(xiàn)蕾期、盛花期和成熟期的紫云英，有機硒含量分別為89.0%、91.7%和93.7%，無機硒含量分別為11.0%、8.30%和6.36%，數(shù)據(jù)說明，紫云英中硒的主體是有機硒，并且隨著紫云英的生長成熟無機硒的比重降低、有機硒的占比上升。此結(jié)果與周乾坤等人[14 - 16]人工施加亞硒酸鈉于土壤或者葉面所培植的紫云英各項硒比例基本一致。

表2 紫云英中的總硒、有機硒與無機硒

*average ± standard deviation(n=5).

植物中的硒有無機形態(tài)的硒(簡稱無機硒)和有機形態(tài)的硒化物(簡稱有機硒)兩種形態(tài)。無機硒主要以單質(zhì)硒、金屬硒化合物、硒酸鹽或者亞硒酸鹽等形式存在于植物之中，其典型特征是價態(tài)多樣性，易溶解于水[9,17]。有機硒的特征是直接與碳成鍵的、并以-2價存在于蛋白質(zhì)、脂肪、多糖和核酸等有機分子中[18]。

2.2 有機硒的賦予形態(tài)

按照實驗方法測定核酸硒、多糖硒和蛋白硒的含量，結(jié)果匯總于表3。表3數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)蕾期紫云英核酸硒、多糖硒和蛋白硒分別為5.70%、15.0%、71.0%，還有約8.30%的其它形態(tài)有機硒；盛花期紫云英核酸硒、多糖硒和蛋白硒分別為3.10%、15.5%、74.6%，其它形態(tài)有機硒約有6.83%；成熟期紫云英核酸硒、多糖硒和蛋白硒分別為2.24%、16.3%、76.2%，其它形態(tài)有機硒約有5.27%。這些數(shù)據(jù)說明：(1)隨著紫云英的生長成熟，蛋白硒和多糖硒有一定程度的增加，而核酸硒和其它形態(tài)有機硒稍有降低的趨勢；(2)按照含硒量由高到低排列，蛋白質(zhì)硒>多糖硒>核酸硒；(3)86%～92%的有機硒主要存在于蛋白質(zhì)和多糖之中，也就是說蛋白質(zhì)和多糖是紫云英中硒的主要賦存形態(tài)。

表3 紫云英中的有機硒形態(tài)

*average ± standard deviation(n=5).

紫云英中有機硒的形態(tài)分布，與刺參[8]、蛹蟲草[9]、藍莓[13]、靈芝[19]、枸杞[20]等植物中有機硒的分布非常相似。其原因可能是，因硒與硫?qū)儆谕恢髯迩倚再|(zhì)相似，無機硒經(jīng)吸收后，硒往往是沿著硫代謝的途徑，產(chǎn)生的一些R-Se-R形式的氨基酸、含硒多肽、硒多糖和含硒RNA等有機分子[21]。

2.3 蛋白硒的賦予形態(tài)

圖1 紫云英中水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性硒蛋白Fig.1 Water-soluble,sodium chloride-soluble,ethanol-soluble and alkali-soluble selenium protein in Astragalus sinicus

為進一步探究紫云英中蛋白硒的存在方式，分別用水、NaCl、乙醇和KOH溶液為浸提液提取紫云英中的水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性硒蛋白等四種蛋白[19]，結(jié)果見表4。表4數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)蕾期紫云英中水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性硒蛋白分別為47.91%、11.23%、9.43%和24.81%，還有約6.62%的其它形態(tài)硒蛋白；盛花期紫云英中水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性硒蛋白分別為41.13%、9.91%、11.75%和29.07%，另有約8.14%的其它形態(tài)硒蛋白；成熟期四種硒蛋白分別為39.45%、7.24%、12.83%和31.23%，有9.25%的其它形態(tài)硒蛋白。各個生長時期的各種硒蛋白的變化規(guī)律于圖1所示。這些數(shù)據(jù)顯示：(1)隨著紫云英的生長成熟，各種溶解性蛋白的含硒量均有增加，但醇溶性、堿溶性和其它形態(tài)硒蛋白的硒比重有一定程度的增加，而水溶性、鹽溶性硒蛋白的硒占比稍有降低；(2)按紫云英中蛋白含硒量從多到少的排序，其為水溶性硒蛋白>堿溶性硒蛋白>醇溶性硒蛋白>鹽溶性硒蛋白；(3)硒蛋白主要以水溶性和堿溶性硒蛋白形式存在，約占得硒蛋白含量的70%，說明紫云英中的蛋白是酸性或極性較強的蛋白[19]。

表4 紫云英中的蛋白硒形態(tài)

*average ± standard deviation(n=5).

一般而言，蛋白質(zhì)依其溶解性可以分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麥谷蛋白和殘渣蛋白等五類[22]。清蛋白為水溶蛋白，分子量較低，溶于水；球蛋白俗稱鹽溶蛋白，易溶于稀鹽水；醇溶蛋白是通過氫鍵和疏水鍵相互作用形成的單鏈蛋白，可用50%～90%乙醇提?。粔A溶性蛋白，又稱麥谷蛋白，是指通過分子間二硫鍵連接多個亞基而成的大分子物質(zhì)，易溶于稀酸或稀堿(其溶解性隨肽鏈上二硫鍵數(shù)目的增加而減小)，但不溶于水、鹽及醇溶液。殘渣蛋白是指具有纖維狀結(jié)構(gòu)，不溶于水，但可以酶解。由于生命體的胃液等為弱酸性，以水溶性和堿溶性硒蛋白為主體的硒蛋白，可以被生命體吸收。

3 結(jié)論

本文采用溶劑提取、微波消解、氫化物發(fā)生-原子熒光光度法等技術，研究了各個生長時期紫云英中硒的賦存形態(tài)。結(jié)果表明，隨著紫云英的生長成熟，總硒含量和有機硒含量逐漸增加，無機硒含量逐漸降低。成熟期的紫云英中，總硒量為1382 μg/kg，有機硒達到總硒的93.7%；有機硒主要以蛋白硒和多糖硒形態(tài)存在，分別占總硒量的76.2%和16.3%；而蛋白硒主要表現(xiàn)為易于被生命體吸收的水溶性硒蛋白和堿溶性硒蛋白形態(tài)，分別占蛋白硒量的39.5%和31.2%。