趙秋伶, 張振宇, 周廣原, 鄭 昊
(1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院,遼寧葫蘆島 125105;2.遼寧工程技術(shù)大學(xué)電子與信息工程學(xué)院,遼寧葫蘆島 125105)
恩諾沙星(Enrofloxacin,ENRX)是一種人工合成的氟喹諾酮類抗菌藥物[1],被廣泛用于畜牧生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中,預(yù)防和治療各種動(dòng)物感染性疾病[2]。ENRX的大量使用造成其在動(dòng)物源性食品中殘留,威脅人類的身體健康,如可引起神經(jīng)中毒、腎功能損傷、過敏反應(yīng)等毒副作用,且有潛在的致癌作用,還會(huì)使病菌產(chǎn)生耐藥性[3 - 5]。世界各國均對(duì)喹諾酮類抗生藥的最高殘留限量(MRL)做出了嚴(yán)格限制。我國及美國均規(guī)定,牛、羊的脂肪與肌肉、奶、腎、肝中的MRL分別為100、100、200和300 μg/kg,豬、兔與家禽等其他動(dòng)物的脂肪與肌肉、肝、腎中的MRL分別為100、200和300 μg/kg[6 - 7]。
目前文獻(xiàn)報(bào)道的ENRX殘留檢測(cè)方法主要有微生物法、色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、熒光法和分光光度法、毛細(xì)管電泳法和免疫學(xué)檢測(cè)法等[8 - 11]。免疫檢測(cè)方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、分析成本底、樣品前處理過程簡單等優(yōu)點(diǎn),適合大樣品量篩查,因而在實(shí)際生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用[12 - 13]?;诤怂徇m配體的酶聯(lián)分析法是一種新型的免疫分析方法[14],用核酸適配體代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體發(fā)展檢測(cè)方法,可以進(jìn)一步提高ENRX殘留檢測(cè)的靈敏度,另外核酸適配體不受外界環(huán)境的干擾,分析結(jié)果重現(xiàn)性高。本研究用自己篩選獲得的ENRX核酸適配體作為識(shí)別探針,建立了一種用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中ENRX殘留的競(jìng)爭取代酶聯(lián)分析方法。研制了ENRX酶聯(lián)分析試劑盒,為ENRX殘留檢測(cè)提供一種新的參考方法。
Spectra Max Paradigm多功能酶標(biāo)儀(美國,Molecular Devices公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國,Millipore公司);Heal Force臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、微量可調(diào)移液器(德國,Eppendorf公司)。
恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、加替沙星、氯霉素、萊克多巴胺(純度>99%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。ENRX核酸適配體序列,3′端生物素(biotin)標(biāo)記:5′-GAAACGAGGTGCTTGACGGTACGATGTTATACCGGGTTAC-biotin-3′(A1);和A1部分互補(bǔ)的核酸序列,5′端異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記:5′-FITC-ATTACCGTCAAGCACCTC-3′(B1);和B1完全互補(bǔ)的核酸序列:5′-biotin-GAGGTGCTTGACGGTAAT-3′(C1),均購自上海生工生物工程有限公司。Anti-FITC-HRP購自美國Millipore公司;鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液購自美國Thermo Scientific公司;恩諾沙星酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒,購自江蘇江萊ELISA研究所;其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
試劑盒組成(96個(gè)反應(yīng)/盒)見表1。使用方法如下:(1)固定DNA:首先向固定磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入A1 200 nmol/L和B1 500 nmol/L,于37 ℃孵育20 min形成部分互補(bǔ)的dsDNA。鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板用200 μL磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBST)洗滌三次,每次5 min。然后在酶標(biāo)板每孔加入100 μL含A1和B1的dsDNA溶液,置于37 ℃搖床,反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢移去反應(yīng)液,凹槽用PBST洗滌三次,保留待用(凹槽1)。用相同的方法在另一鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板的凹槽上固定DNA C1(C1的濃度為300 nmol/L),保留待用(凹槽2)。(2)檢測(cè)ENRX:ENRX用結(jié)合緩沖液稀釋成不同濃度,加入到待用凹槽1,每口100 μL,室溫反應(yīng)30 min;反應(yīng)完畢,用移液器吸出反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到待用凹槽2,37 ℃搖床反應(yīng)20 min;然后移去反應(yīng)液,用PBST洗滌三次,每次5 min,每口加100 μL anti-FITC-HRP,37 ℃反應(yīng)30 min,移去反應(yīng)液,洗滌三次,最后加100 μL TMB-H2O2底物顯色液,反應(yīng)20 min,加25 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。反應(yīng)液由藍(lán)變黃,用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm波長處的吸光度。
表1 試劑盒的組成
(1)添加回收實(shí)驗(yàn):選取新鮮肌肉組織(高效液相色譜法已驗(yàn)證無ENRX)作為添加回收實(shí)驗(yàn)樣品。其前處理方法如下:稱取均質(zhì)后肌肉組織3份,每份各1 g,置于3個(gè)15 mL離心管中,分別添加25、50、100 ng ENRX標(biāo)準(zhǔn)品,靜置10 min后分別加入4 mL超純水,充分振蕩均勻,然后用離心機(jī)以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,分別吸取上層清液2 mL于3個(gè)10 mL離心管中,加入2 mL正己烷,振蕩10 min,以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,除去上層正己烷層,取下層清液50 μL待測(cè)。
(2)實(shí)際樣品檢測(cè):從興城南關(guān)集貿(mào)市場(chǎng)采集鮮肉樣本,共30份,依照添加回收實(shí)驗(yàn)的處理步驟處理鮮肉樣品。用研制的試劑盒進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)用商用的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒做對(duì)照和驗(yàn)證。
核酸適配體A1擁有40個(gè)堿基序列,前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明和ENRX作用的結(jié)合域包含在5′端的16個(gè)堿基里,而非后面的莖-環(huán)序列[15]?;贏1核酸適配體的結(jié)合域位于一端且不形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),我們?cè)O(shè)計(jì)了競(jìng)爭取代酶聯(lián)分析檢測(cè)策略,見圖1。當(dāng)A1的3′端生物素標(biāo)記可以被固定到鏈霉親和素標(biāo)記的酶標(biāo)板上。B1共18個(gè)堿基,除了5′端的兩個(gè)堿基之外,其余16個(gè)堿基和A1中5′端的16個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì),見圖1中A1和B1粗體部分。B1與A1能形成部分互補(bǔ)的dsDNA,通過雜交作用,B1也被固定到酶標(biāo)板上。加入ENRX后,由于ENRX同其適配體的親和力大于雙鏈互補(bǔ)力,形成穩(wěn)定的ENRX/aptamer復(fù)合物,F(xiàn)ITC標(biāo)記的B1自dsDNA上解離下來。取出含B1的溶液轉(zhuǎn)移到固定了C1的酶標(biāo)板凹槽,通過雙鏈互補(bǔ)配對(duì)原則,B1被C1捕獲。FITC能捕獲帶HRP標(biāo)簽的FITC抗體,HRP能催化TMB底物顯藍(lán)色,加入2 mol/L酸后藍(lán)色產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。
圖1 競(jìng)爭取代酶聯(lián)適配體分析的示意圖Fig.1 Detection principle diagram of enzyme-linked aptamer assay with competition replacement mechanism
圖2 (A)檢測(cè)不同濃度ENRX的照片;(B)450 nm的紫外吸收與ENRX濃度的關(guān)系曲線(插圖(C)為(B)曲線中的線性部分)Fig.2 (A)Photographs of detecting different concentrations of ENRX;(B)Relationship between the UV absorption of 450 nm and the concentration of ENRX;(Inset:(C)is the linear part of (B) curve)The experimental conditions:[A1]=20 pmol/well,[B1]=50 pmol/well,[C1]=30 pmol/well,[ExoI]=5 U/well,[anti-FITC-HRP]=12.5 ng/well,[TMB]=1.2 mmol/L.The error bar represented the standard deviation of the three independent experiments.
在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下,競(jìng)爭取代酶聯(lián)適配體分析試劑盒測(cè)定不同濃度ENRX的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2(A)照片可以看出,隨著ENRX濃度的增加,溶液的顏色逐漸加深。肉眼觀察的檢測(cè)限為200 nmol/L(相當(dāng)于72.0 μg/kg)。相應(yīng)的,從圖2(B)可以看出,隨著ENRX濃度的增加,A450吸光度不斷增大,開始時(shí)增加很快,后來趨于緩慢。在100~700 nmol/L(相當(dāng)于35.9~251.6 μg/L)范圍內(nèi),在450 nm處的凈吸收值(A450-A450(blank))與ENRX的濃度呈良好的線性關(guān)系(圖2(C))。以信噪比大于3為可測(cè)信號(hào)標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到ENRX的檢測(cè)限為75.0 nmol/L(相當(dāng)于26.9 μg/L)。歐盟對(duì)ENRX在肌肉組織中的最大殘留限量(MRL)作出明確規(guī)定,要求不高于30 μg/kg。我國對(duì)動(dòng)物源性食品中ENRX的要求是肌肉組織中ENRX的MRL不高于100 μg/kg。所以,研制的試劑盒可以滿足我國規(guī)定的檢測(cè)需求,也能滿足歐盟高標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)需求。
2.3.1添加回收實(shí)驗(yàn)及精密度采用上述研制的酶聯(lián)適配體分析試劑盒,對(duì)豬肉、羊肉、魚肉進(jìn)行檢測(cè),分別添加25、50、100 ng/g 3個(gè)濃度水平的ENRX,取同一批次包被板,對(duì)同種樣品進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù),再取不同批次的包被板,對(duì)同種樣品進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算批間變異系數(shù),分別得到相同及不同批次樣品的精密度,結(jié)果見表2。由表2可知所建立方法對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度良好,符合檢測(cè)要求。
表2 鮮肉樣品添加回收實(shí)驗(yàn)(n=5)
2.3.2特異性選擇諾氟沙星、加替沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、萊克多巴胺作為參照物,在相同測(cè)試條件下,當(dāng)ENRX的濃度為1 μmol/L,而其它物質(zhì)濃度為10 μmol/L時(shí),比較450 nm波長處的凈吸收值(凈吸收值=A450-A450(blank)),并計(jì)算交叉反應(yīng)率P/N(P為對(duì)照物的凈吸收值,N為ENRX的凈吸收值)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,交叉反應(yīng)率P/N均小于4%,與環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星的交叉反應(yīng)率分別為3.46%、2.89%和2.33%,與其他結(jié)構(gòu)類似物和功能類似物的交叉反應(yīng)率均小于2%,說明除了加入恩諾沙星的體系外,其它體系檢測(cè)結(jié)果的凈吸收值都沒有明顯的提高(即使其它6個(gè)參照物濃度提高了10倍),表明該方法對(duì)ENRX的檢測(cè)具有較高的特異性。
2.3.3穩(wěn)定性試劑盒經(jīng)-20 ℃到室溫的反復(fù)凍融后的測(cè)試結(jié)果顯示,反復(fù)凍融60次后An/A0為0.86,0.86>0.8,說明檢測(cè)體系的凈吸收值沒有明顯變化,即試劑盒穩(wěn)定性良好。
2.3.4保存期限試劑盒保存前測(cè)得的凈吸收值為A0,試劑盒保存一段時(shí)間取出后測(cè)得的凈吸收值為Am,計(jì)算Am/A0,當(dāng)Am/A0≤0.8時(shí),認(rèn)定試劑盒失效。由表3有效期試驗(yàn)結(jié)果可知,試劑盒在37 ℃,保存一周失效。試劑盒在4 ℃可以保存半年以上,試劑盒在-20 ℃可保存3年。
表3 試劑盒有效期實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.3.5成本分析試劑盒中的成分除了DNA和Anti-FITC-HRP都是常規(guī)試劑。就目前合成技術(shù),DNA已能夠批量合成,合成2 OD用量時(shí)上去一個(gè)堿基10元左右,做96口反應(yīng)需DNA 0.4~0.6 OD;100 μL Anti-FITC-HRP 395美元,做96口反應(yīng)需2 μL足夠。再加上其它試劑,一個(gè)能做96口反應(yīng)的試劑盒大約四百元,比市售的常規(guī)酶聯(lián)免疫分析試劑盒便宜。隨著DNA合成技術(shù)的進(jìn)步,如果能在DNA上直接標(biāo)記HRP,將不必使用Anti-FITC-HRP,還將大大降低成本。
應(yīng)用本試劑盒檢測(cè)興城南關(guān)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集的30個(gè)鮮豬肉樣本,結(jié)果18個(gè)樣本檢出有ENRX殘留,其中5個(gè)樣本的殘留量在42.3~100.2 μg/kg之間,低于我國規(guī)定的最大殘留限量,13個(gè)樣本的殘留限量在101.3~182.0 μg/kg之間,高于我國規(guī)定的最高殘留限量。我們研制的試劑盒的檢測(cè)結(jié)果和商用的ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果基本一致,ELISA試劑盒也檢出18個(gè)樣本有ENRX殘留,殘留量在40.1~158.4 μg/kg之間。說明研制的試劑盒可信度高,能用于檢測(cè)實(shí)際樣本中的ENRX殘留。
本文研制了ENRX的酶聯(lián)適配體分析檢測(cè)試劑盒,該試劑盒的檢測(cè)限為26.9 μg/L,線性檢測(cè)范圍為35.9~251.6 μg/L;應(yīng)用于各樣品的添加回收率均落在93%~110%之間,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%;與結(jié)構(gòu)類似物和功能類似物的交叉反應(yīng)率都小于4%;在-20 ℃環(huán)境中,能保存3年以上,在4 ℃環(huán)境中,能保存6個(gè)月以上;穩(wěn)定性好,抵抗反復(fù)凍融至少60次。本文研制的試劑盒的靈敏度高、特異性強(qiáng),具有準(zhǔn)確、快速、簡便的優(yōu)點(diǎn),能夠滿足動(dòng)物源性食品中ENRX的快速篩查的需求。