張博睿

【摘要】為了鑒定分析球囊菌（Ascosphaera apis）幾丁質(zhì)酶基因分子特征，預(yù)測其編碼蛋白的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)對(duì)球囊菌幾丁質(zhì)酶基因Am-KZZ89578進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)其編碼氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示， Am-KZZ89578基因全長958bp， 編碼 421個(gè)氨基酸。多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，Am-KZZ89578蛋白為幾丁質(zhì)酶GH18家族Group-Ⅲ亞家族成員，該蛋白的預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)呈彎曲螺旋結(jié)構(gòu)形式。本實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)為球囊菌幾丁質(zhì)酶基因編碼蛋白的生物學(xué)功能研究提供了基礎(chǔ)參考。

【關(guān)鍵詞】球囊菌 幾丁質(zhì)酶 基因 PCR

【中圖分類號(hào)】G633.91 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-3089（2018）37-0131-03

幾丁質(zhì)（Chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖胺以β-1-4-糖苷鍵鏈接而成的線性多聚糖[1]，在自然界中幾丁質(zhì)是昆蟲表皮的重要組成部分，參與昆蟲表皮幾丁質(zhì)的降解，在昆蟲的脫皮發(fā)育與生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用[2]。幾丁質(zhì)酶是能夠降解幾丁質(zhì)的關(guān)鍵酶之一，昆蟲的幾丁質(zhì)酶屬于GH18家族的內(nèi)切酶，主要存在于昆蟲的體壁，脂肪體等組織，能夠把幾丁質(zhì)水解成N-乙酰-D-氨基葡萄糖或寡聚物[1]。

蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是引起蜜蜂真菌傳染病——白堊?。–halkbrood disease）病原。昆蟲病原真菌能通過分泌幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等多種水解酶，來達(dá)到降解昆蟲腸道圍食膜和體壁幾丁質(zhì)保護(hù)層的作用。昆蟲病原真菌超量表達(dá)幾丁質(zhì)酶和蛋白酶基因會(huì)提高菌株的毒力[3]。因此，對(duì)球囊菌幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行鑒定和分析，將有助于了解幾丁質(zhì)酶在病原真菌入侵昆蟲中的功能。

本研究對(duì)球囊菌幾丁質(zhì)酶基因Am-KZZ89578進(jìn)行克隆鑒定，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測該基因編碼的氨基酸序列和3D的結(jié)構(gòu)特征，分析其蛋白在幾丁質(zhì)酶家族成員中的分類和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，以便為深入探討球囊菌幾丁質(zhì)酶在入侵昆蟲過程中的作用和以后防治措施提供基礎(chǔ)資料。

1.材料與方法

1.1材料及主要試劑

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等試劑購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒、PCR試劑盒、連接酶、抗生素等試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 DNA樣本制備

培養(yǎng)和純化球囊菌，加酒精，滅菌雙蒸餾水清洗3次，吸干。將組織放入液氮研磨充分后轉(zhuǎn)入離心管，56℃水浴1h，5-6min顛倒一次，用CTAB法提取DNA，700μL 2% CTAB，20μL 10% SDS，40μLβ-巰基乙醇，20μL 蛋白酶K。12000r/min離心，10min， 吸取上清，加等體積事先配好的苯酚、氯仿、異戊醇，比例為25：24：1，強(qiáng)烈混勻3min，然后12000r/min離心，5-10min。取上層溶液，加等體積氯仿，異戊醇，比例為24：1，12000r/min離心5min。取上層溶液，加2/3體積異丙醇，1/10提及的5mol/L PH5.2醋酸鈉，輕混1min，-20℃沉淀1h，12000r/min離心5min。棄上清，加70%乙醇1mL漂洗，12000r/min離心3-10min，加60μL TE Buffer，0.6μL RNA酶，封口膜封號(hào)，37℃孵育搖床30min，電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)球囊菌中幾丁質(zhì)酶基因的參考序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為：F：GGGGTACCATGATGTTCTCTAAGCTTTC； R：CCGCTCGAGCCGGGCTTGACAACTTTGCA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，TaqPCR 72μL；上，下游引物（mol/L）各6μL；DNA模板6μL，滅菌雙蒸餾水60μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變4min；94℃變40s；59.2℃退火40s；72℃延伸10 min，35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4目的基因克隆及序列分析

用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收目的基因片段，鏈接T載體，16℃恒溫儀上連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，含LB瓊脂平板篩選，選取陽性菌落37℃氨芐青霉素（100μg/mL）LB瓊脂平板篩選，選取陽性菌落37℃培養(yǎng)12～16h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，經(jīng) PCR 鑒定正確后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NovoPro將DNA序列翻譯成氨基酸序列，然后利用Mega7.0和ClustalX與（Tc-NP_001034524.1； Tc-NP_0010

36067.1； Tc-NP_001036035.1； Ag-XP_315650.4； Ag-XP_0016

87765.2； Dm-NP_611542.2； Am-XP_006572082.1）6個(gè)代表物種的幾丁質(zhì)酶序列進(jìn)行同源性比對(duì)與進(jìn)化樹分析。采用SWISSMODEL軟件（https：//www.swissmodel.expasy.org）預(yù)測蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)。

2.結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用球囊菌幾丁質(zhì)酶基因Am-KZZ89578特異性引物對(duì)其DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的條帶長約958bp，與預(yù)期片段大小一致，說明實(shí)驗(yàn)已成功擴(kuò)增出球囊菌幾丁質(zhì)酶基因。

圖1 球囊菌幾丁質(zhì)酶Am-KZZ89578基因PCR分析

2.2 目的基因測序結(jié)果

回收目的基因進(jìn)行克隆與鑒定后，對(duì)養(yǎng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果見圖，由圖，球囊菌幾丁質(zhì)酶基因全長958 bp，編碼421個(gè)氨基酸。

推導(dǎo)編碼的氨基酸序列：

MMFSKLSVMPLLASLTAARFVAYIDQDHNSTLPSKSLT

GEIDHVILAFVQSSMLYNESTIVKWWDLPKIKSHFKENTTF

MVSIGGDPDFKQGFHKAVQSDESRKSYARKVANFVKREG

FDGVDIDWKYPGGITENETVEIRGFPSLLQEIRKAIGKNMT

LSIASPGVKKYMHAYTRQHAPNINAVDFLNILTEDQMDN FSNTTDYLSGISSCNDTISAYLELGMPPEKGNLGMPFYGQG

YSVEPDCKHGLGCKVVKPGEKKGKVVGQVSSFMWTAMY

MDANPPSKNASVAKDGEMCGPDTKKICPGKACCSPSGYC

GTTEDYCGWNCLPAWGHCNGSTSIGSFQKARKDKSAVT

DQGAFYLDKENNFFWTWDPAENYGDKYHTVIKDNKLGG

VMVWSLGEDSYDWSHLKKLSAVIKQHRM

2.3 球囊菌幾丁質(zhì)酶Am-KZZ89578氨基酸序列的多重比對(duì)分析

圖2Am-KZZ89578蛋白的氨基酸序列特征和多序列對(duì)比分析

注：方框內(nèi)陰影部分為保守的催化結(jié)構(gòu)域：Ag-岡比亞按蚊，Dm-黑腹果蠅，Am-意大利蜜蜂，Tc-赤擬谷盜

將球囊菌幾丁質(zhì)酶Am-KZZ89578氨基酸序列與岡比亞按蚊、黑腹果蠅、意大利蜜蜂、赤擬谷盜的幾丁質(zhì)酶序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖2所示。Am-KZZ89578的催化區(qū)含有幾丁質(zhì)酶的4個(gè)典型催化功能基序，分別為“KxxxxxGG”，“FDGxDLDWEFP”，“MxYDxxF”，“GAMxLxxNxD”[4]。這表明Am-KZZ89578蛋白與已報(bào)道的GH18家族Group-Ⅲ型幾丁質(zhì)酶的序列特征相似。

2.4 球囊菌幾丁質(zhì)酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用ClustalX 和 Mega7.0軟件對(duì)球囊菌幾丁質(zhì)酶KZZ89587與其他代表物種昆蟲幾丁質(zhì)酶對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果見圖3，由圖3可知，球囊菌幾丁質(zhì)酶基因與 GH18家族GroupⅢ的親緣關(guān)系最近， 同處于一個(gè)遺傳進(jìn)化分支上。

圖3 球囊菌幾丁質(zhì)酶Am-KZZ89578基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5球囊菌幾丁質(zhì)酶基因蛋白分子特征預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)

利用SWISS-MODEL軟件對(duì)球囊菌幾丁質(zhì)酶基因編碼蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果見圖4。

圖4 球囊菌幾丁質(zhì)酶Am-KZZ89578基因編碼蛋白

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

由圖4可知，球囊菌幾丁質(zhì)酶KZZ89578基因編碼蛋白在三級(jí)結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)出彎曲螺旋結(jié)構(gòu)形式。KZZ89578的催化結(jié)構(gòu)區(qū)含有 7個(gè)α-螺旋和 6個(gè)β-折疊。

3.討論

球囊菌通過幾丁質(zhì)酶降解昆蟲體壁的幾丁質(zhì)來達(dá)到穿透體壁的目的，不同亞家族幾丁質(zhì)酶在昆蟲的生命活動(dòng)中會(huì)參與不同的生理過程[2]。有研究報(bào)道，赤擬谷盜幾丁質(zhì)酶Group-Ⅲ成員并未參與到赤擬谷盜幾丁質(zhì)酶Group-Ⅲ的蛻皮，而是在化蛹時(shí)腹部收縮和翼/鞘翅中發(fā)揮重要作用[5]。本研究分析結(jié)果表明，球囊菌幾丁質(zhì)酶Am-KZZ89578屬于幾丁質(zhì)酶Group-Ⅲ亞家族成員，推測Am-KZZ89578蛋白可能在球囊菌在蜜蜂幼蟲腸道中通過降解腸道圍食膜幾丁質(zhì)壁，進(jìn)而成功侵入蜜蜂腸道組織中發(fā)揮著作用。

4.結(jié)論

球囊菌幾丁質(zhì)酶Am-KZZ89578基因全長958bp， 可編碼421和氨基酸，其編碼氨基酸序列中幾丁質(zhì)酶特有的活性基序高度保守，系統(tǒng)進(jìn)化上為幾丁質(zhì)酶Group-Ⅲ家族成員，三級(jí)結(jié)構(gòu)成彎曲螺旋結(jié)構(gòu)形式。

參考文獻(xiàn)：

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[3]劉朋虎.蜜蜂球囊菌幾丁質(zhì)酶純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究.福建農(nóng)林大學(xué)，2007.

[4]PAN Y，LU P， WANG Y，et al. In silico identification of novel chitinase？鄄like proteins in the silkworm， Bombyxmori， genome[J]. Journal of Insect Science， 2012（150）：1-14.

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