陳洪英 ，王海

（1.成都心血管病醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 成都 610000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610000）

0 引言

原發(fā)性高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂以及尿酸過量產(chǎn)生或排泄減少所引起的一種多基因疾病，這種疾病由于高發(fā)病率且能導(dǎo)致多器官損傷，其復(fù)雜的機(jī)制和治療局限性是國際醫(yī)學(xué)界面臨的一個難題[1]。腎臟是尿酸代謝的主要器官，通過腎臟排泄的大量尿酸晶體直接介導(dǎo)并參與腎損傷的發(fā)展。此外，高尿酸血癥可以過度激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)和內(nèi)皮素并導(dǎo)致高血壓，損傷腎小動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能并刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖。這些過程可導(dǎo)致腎小球輸入動脈壁硬化和增厚進(jìn)而引起繼發(fā)性腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化[2]。丹參川穹嗪含有四甲基吡嗪、丹參酮和丹參酸等，能夠改善患者血管微循環(huán)并降低患者體內(nèi)炎性因子含量，對治療糖尿病腎病有一定作用效果[3]。尿酸腎病的發(fā)病機(jī)制較多但是相關(guān)研究很少，本研究通過建立高尿酸血癥誘導(dǎo)的大鼠腎損傷模型，探討丹參川穹嗪干預(yù)高尿酸誘導(dǎo)腎損傷的分子機(jī)制并為治療尿酸性腎病提供新的思路。

1 材料

1.1 動物

健康雄性Sprague Dawley大鼠，體重為190-210g，購于江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司[證書號SYXK(蘇)2016-0056]。SPF鼠飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司提供[貨號：xt007]。

1.2 藥物，試劑和儀器

丹參川穹嗪購于貴州拜特制藥有限公司，每支5mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。別嘌呤醇膠囊0.25 g/片(共10片)(批號15010901)購于黑龍江省奧力達(dá)奈德制藥有限公司。腺嘌呤(批號A8626)和羧甲基纖維素鈉(批號21902)購于Sigma-Aldrich公司。大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(批次No.M1752164)購于深圳欣博盛生物科技有限公司?？筎LR4抗體(批號ab13556)，抗FOXO3α抗體(批號ab12162)和抗NLRP3抗體(批號ab214185)購自于Abcam公司。HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號CW2569)購于杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司。KAPA SYBR? FAST qPCR Kit Master Mix (2x)(批號KK4601) 購于上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司。所使用的儀器是HC-3018R高速冷凍離心機(jī)；5810R臺式冷凍離心機(jī)；JY300C電泳儀和電泳槽，JY-2Y1轉(zhuǎn)膜儀；ChampGel5000凝膠成像儀；StepOne Plus實時定量PCR儀；MULTISKAN MK3全自動多功能酶標(biāo)儀。

2 方法

2.1 建模，分組和干預(yù)

大鼠自由獲取水和食物并適應(yīng)環(huán)境1周后，將大鼠隨機(jī)分為正常對照組(n=6)和造模組(n=30)。正常對照組蒸餾水灌胃10mL/kg每天并喂食正常飲食。將腺嘌呤溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中并通過灌胃給予造模組100mg/kg每天，連續(xù)18天。從大鼠眼眶采血，當(dāng)血尿酸水平高于82.50μmol/L且與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)時認(rèn)為大鼠高尿酸血癥模型造模成功。收集籠中模型大鼠的24小時尿液，當(dāng)發(fā)現(xiàn)尿蛋白濃度顯著高于正常組時，表明腎損傷且是尿酸造成的腎損傷。將30只模型大鼠通過隨機(jī)數(shù)表分為模型組，別嘌呤醇（5mg/kg灌胃）陽性藥物組和低、中、高劑量(10、20、40mg/kg灌胃)丹參川穹嗪組，每組6只，干預(yù)持續(xù)6周。

2.2 標(biāo)本收集

6周灌胃后，隨機(jī)選取各組大鼠一半，腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后通過腹主動脈取血。離心收集血清，收集上清液于-80℃保存，用于ELISA和生化指標(biāo)檢測。收集血液后處死大鼠并取出腎臟。將腎冷凍并儲存在液氮中用于隨后的RT-PCR和Western blot分析。

2.3 指標(biāo)檢測

采用RT-PCR檢測腎組織中FOXO3α，TLR4，NLRP3和MCP-1基因轉(zhuǎn)錄水平，TriZol提取100mg腎組織RNA以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR反應(yīng)液 為10μL包 含SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)5μL加 上 游 引 物 (10μmol/L)0.2μL加 下游 引物 (10μmol/L)0.2μL加 cDNA 1μL加不 含 核酸酶的超純水(3.6μL)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，退火5s，60℃延伸34s，共40個循環(huán)。進(jìn)行溶解曲線分析以鑒定PCR產(chǎn)物的特異性。引物設(shè)計和合成見表1。Western blotting檢測腎組織中FOXO3α，TLR4和NLRP3蛋白的表達(dá)，將100mg腎組織添加到1mL蛋白質(zhì)提取試劑中混勻。離心后收集上清液，用二辛可寧酸測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將樣品蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至相同水平，加入樣品緩沖液，并在95℃變性5min之后儲存以備后用。使用8%，10%和12%分離凝膠和5%間隔凝膠進(jìn)行SDS聚丙烯凝膠電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)跑到凝膠的末端時電泳終止。濕膜轉(zhuǎn)移90min。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉。稀釋一抗并放入PVDF膜在4℃下孵育過夜。將二抗體以1：10000的比例稀釋并與PVDF膜孵育40min?；瘜W(xué)發(fā)光顯影后掃描蛋白質(zhì)條帶并分析。ELISA用于檢測血清MCP-1蛋白水平，根據(jù)制造商說明進(jìn)行ELISA。

表1 引物設(shè)計

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，GraphPad Prism7軟件繪圖。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()。單因素方差分析用于多組比較。兩組之間使用最小顯著性差異檢驗（LSD）進(jìn)行比較。P值＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 腎組織中FOXO3α，TLR4，NLRP3和MCP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

在第6周時與正常組相比，模型組FOXO3α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，TLR4、NLRP3和MCP-1的mRNA水平顯著上調(diào)(P＜0.05)。與模型組相比，丹參川穹嗪3組的FOXO3α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，3組丹參川穹嗪組的TLR4、NLRP3和MCP-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)(P＜0.05,圖1)。

3.2 腎組織中FOXO3α，TLR4和NLRP3蛋白水平

第6周與正常組相比，模型組FOXO3α的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，TLR4和NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。第6周與模型組相比，丹參川穹嗪3組的FOXO3α蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上調(diào)，TLR4和NLRP3蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05，圖2)。

圖1 丹參川穹嗪對尿酸性腎病大鼠FOXO3α，TLR4，NLRP3和MCP-1基因表達(dá)的影響

圖2 丹參川穹嗪對尿酸性腎病大鼠FOXO3α，TLR4和NLRP3蛋白表達(dá)的影響

圖3 丹參川穹嗪對尿酸性腎病大鼠血清MCP-1蛋白表達(dá)的影響

3.3 血清中MCP-1蛋白表達(dá)水平

在第6周與正常組相比，模型組在6周時血清MCP-1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05)。與模型組相比，3組丹參川穹嗪組血清MCP-1蛋白表達(dá)水平在第6周顯著下調(diào) (P＜0.05，圖3)。

4 討論

丹參川穹嗪可改善改善血管內(nèi)皮功能和腎臟的微循環(huán)灌注狀態(tài)，清除炎性細(xì)胞因子同時實現(xiàn)腎功能保護(hù)[4]。TLR是一種I型跨膜蛋白，是先天性免疫系統(tǒng)的主要模式識別受體。在高尿酸血癥分子水平研究中發(fā)現(xiàn)Toll樣受體（TLR）介導(dǎo)的免疫信號通路和冷炎素（cryopyrin）炎癥信號通路能夠被尿酸鹽激活[5]。TLR在哺乳動物中能將細(xì)胞外抗原識別信息傳遞到細(xì)胞中并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[6]。TLR和相應(yīng)配體結(jié)合導(dǎo)致一系列蛋白級聯(lián)反應(yīng)，包括激活NF-κB和JUN/FOS從而誘導(dǎo)許多快速反應(yīng)基因的激活并產(chǎn)生參與炎癥反應(yīng)的效應(yīng)分子。TLR4在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主導(dǎo)作用，TLR4通過著名的TLR4/NF-κB炎癥通路誘導(dǎo)并激活NF-κB參與腎損傷微炎癥狀態(tài)的發(fā)展并介導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展[7]。研究表明，在白細(xì)胞活化后，尿酸鹽通過先天性免疫系統(tǒng)中的TLR2和TLR4激活炎性因子，然后激活白細(xì)胞介素[1]，導(dǎo)致炎癥效應(yīng)和組織損傷[8]。我們的研究結(jié)果表明，丹參川穹嗪有效地下調(diào)了TLR4的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，丹參川穹嗪可能通過抑制TLR信號通路減輕尿酸性腎病大鼠腎臟炎癥反應(yīng)，從而減輕腎臟損傷。

冷炎素(cryopyrin)也被稱為NALP3，是編碼細(xì)胞內(nèi)NOD樣受體(NLRs)家族成員，參與炎癥復(fù)合體的形成，主要在中性粒細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞和一些原代免疫細(xì)胞中表達(dá)[9]。在我們的研究中模型組NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組，提示過表達(dá)的NLRP3在高尿酸血癥性腎病大鼠中介導(dǎo)免疫炎性腎組織損傷。腎小管上皮細(xì)胞的MCP-1表達(dá)水平與腎小球損傷程度相關(guān)，腎間質(zhì)局部產(chǎn)生的MCP-1也參與腎小管間質(zhì)損傷。MCP-1通過作用于腎小管上皮細(xì)胞激活NF-κB并增加IL-6和細(xì)胞間粘附分子1的表達(dá)[10]。腎臟中的尿酸鹽沉積直接刺激腎組織中MCP-1蛋白表達(dá)的增加，并通過激活NF-κB誘導(dǎo)炎性因子激活，引起腎血管炎癥反應(yīng)和巨噬細(xì)胞浸潤并促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[11]。在我們的研究中尿酸性腎病模型大鼠血清中MCP-1蛋白顯著高表達(dá)，丹參川穹嗪和別嘌呤醇能逆轉(zhuǎn)模型組大鼠腎臟中NLRP3和血清中MCP-1蛋白的表達(dá)，改善腎臟炎癥病變，我們推測NLRP3和MCP-1可能作為治療高尿酸血癥性腎病新的藥物治療靶點。

FOXO3α是叉頭框蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子的成員，最近的研究表明它在抑制炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[12]。FOXO3α也可能通過調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞的數(shù)量和功能或抑制單核巨噬細(xì)胞的過度活化而參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[13]。研究已經(jīng)報道FOXO3α基因缺失小鼠的脾內(nèi)發(fā)生了炎性細(xì)胞浸潤，F(xiàn)OXO3α基因缺陷小鼠與野生型小鼠相比NF-κB活化明顯增強(qiáng)并引起T細(xì)胞自發(fā)性增殖及慢性炎癥細(xì)胞浸潤[14]。FOXO3α也是P13K/Akt信號通路的下游分子，炎癥信號通過磷酸化激活PI3K/Akt從而誘導(dǎo)Akt與核內(nèi)FOXO3α結(jié)合并致其磷酸化，磷酸化的FOXO3α從DNA的結(jié)合位點分離出來，并從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而降低其轉(zhuǎn)錄活性并阻斷TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]。在病原體激活的抗原呈遞細(xì)胞中FOXO3α可抑制TNF-α和IL-6等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[16]。因此，F(xiàn)OXO3α對調(diào)節(jié)免疫介導(dǎo)的炎癥具有 重要的生物學(xué)作用。

我們的研究結(jié)果表明，丹參川穹嗪顯著上調(diào)大鼠腎組織中FOXO3α的mRNA和蛋白表達(dá)，可以抑制免疫炎癥關(guān)鍵信號分子TLR4，NLRP3和MCP-1的生物學(xué)活性。我們推測丹參川穹嗪能夠改善高尿酸血癥介導(dǎo)的腎臟免疫炎癥損傷。