李世琪 閆 妍 翟 慧 王政艷 程金芝** 吳家紅**

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)現(xiàn)代病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；貴州貴陽(yáng) 550025； 2. 淮北礦工總醫(yī)院皮膚科，安徽淮北 235000)

白紋伊蚊Aedesalbopictus，又稱“亞洲虎蚊”，起源于亞洲，現(xiàn)已擴(kuò)散至全球70多個(gè)國(guó)家，不僅刺叮吸血，而且可以傳播登革熱、基孔肯雅熱、寨卡熱等重要的蟲媒疾病(陸寶麟，1999; Liuetal., 2017)，成為全球重要的媒介蚊蟲之一(楊舒然等, 2013)。在我國(guó)，它北至遼寧，南至海南。

通過吸血，媒介蚊蟲不僅可以獲得營(yíng)養(yǎng)、繁殖后代，還可以通過唾液與宿主發(fā)生相互作用，促進(jìn)病原的傳播。為獲取血餐，吸血節(jié)肢動(dòng)物進(jìn)化了一系列的具有生物學(xué)活性的唾液組分蛋白以對(duì)抗宿主的凝血機(jī)制和免疫反應(yīng)，包括血液凝集抑制劑、血小板聚集抑制劑、血管收縮劑以及免疫調(diào)控分子等?，F(xiàn)有研究表明這些生物活性物質(zhì)具有種特異性。物種不同，唾液組分中的抗凝血、免疫調(diào)控的機(jī)制也不相同(Kazimírováetal., 2002; Wanasenetal., 2004)。

蚊蟲唾液是一組具有潛在藥理活性的液體，不僅可干擾宿主的凝血反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以促進(jìn)吸血的完成，更重要的是可調(diào)控宿主的免疫反應(yīng)，促進(jìn)病原的傳播(吳家紅等, 2008)。白紋伊蚊作為我國(guó)重要的媒介蚊蟲之一，對(duì)白紋伊蚊雌蚊唾液組分生物學(xué)活性的研究鮮有報(bào)道。本研究以白紋伊蚊唾液腺勻漿粗蛋白(salivary gland extract，SGE)為研究對(duì)象，探究其在宿主血小板聚集及血液凝集過程中可能發(fā)揮的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲和血液來(lái)源

蚊蟲：白紋伊蚊廣州株2006 年 8 月引自軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，在本研究室常規(guī)養(yǎng)殖。溫度 25℃±2℃，濕度為(80±5)%，光照14 h/d，羽化后喂食10%葡萄糖溶液。

血液來(lái)源：健康志愿者靜脈血。健康志愿者納入標(biāo)準(zhǔn)為14 d內(nèi)無(wú)任何服藥史，無(wú)冠心病及其家族史，無(wú)高血壓、高血脂、高血糖，經(jīng)一般生化檢查未見明顯凝血功能異常。同時(shí)排除有血小板功能障礙病史，以及血液系統(tǒng)疾病者。年齡在 20～30 歲之間共6人(3男，3女)，每人于肘靜脈取血30 mL。采集和使用均遵守醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器

Ⅰ型膠原、凝血酶購(gòu)自北京solarbio試劑公司；ADP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；凝血酶時(shí)間(TT)測(cè)定試劑盒、凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定試劑盒、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司；Micro BCA Protein Assay kit (Pierce, Rockford, IL)購(gòu)自寶生物公司；血小板聚集儀(LBY-NJ4)為北京普利生儀器有限公司產(chǎn)品；M530酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 白紋伊蚊雌蚊唾液腺勻漿粗蛋白樣品制備

采用剝頭法解剖白紋伊蚊雌蚊唾液腺。取3～5日齡未吸血雌蚊唾液腺置于100 μL冰浴PBS中。每管置入唾液腺100對(duì)，充分勻漿后于4℃，12 000 r/min離心20 min，吸取上清保存于-80℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)蛋白檢測(cè)試劑盒說明書配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品溶液和工作液，570 nm下測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述制備好的SGE 25 μL，加入到含有 200 μL 工作液的酶標(biāo)板中，37℃孵育 30 min 后在 570 nm 下測(cè)定吸光度值，重復(fù)3孔，求平均值；利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

1.4 SGE抗血小板聚集作用

1.4.1富血小板血漿及貧血小板血漿的制備: 肘靜脈取血 20 mL，用 0.109 mol/L枸櫞酸鈉溶液與全血(1∶9)體積比混合抗凝。以1000 r/min離心10 min。得到上層液即為富血小板血漿(platelet rich plasma, PRP)，余下血樣以 3 600 r/min 離心10 min，得到貧血小板血漿(platelet poor plasma, PPP)。用 PPP 調(diào)整 PRP 中的血小板數(shù)為 3×1011個(gè)/L。制備好的 PRP 應(yīng)在2 h內(nèi)用完。

1.4.2SGE抗血小板聚集作用: 將低、中、高濃度SGE(0.033、0.1、0.1667 μg/μL)分別與PRP 37℃預(yù)溫5 min，空白對(duì)照加入等體積PPP，分別以ADP(5 mmol/L)、Ⅰ型膠原蛋白(5 mg/mL)、凝血酶(1 U/mL)為誘導(dǎo)聚集劑，采用比濁法測(cè)定血小板5 min最大聚集率，并計(jì)算血小板聚集抑制百分率。血小板聚集抑制百分率(%)=[(對(duì)照組血小板聚集率%-實(shí)驗(yàn)組血小板聚集率%)/對(duì)照組血小板聚集率%]×100%(Kazimírováetal.,2002)。

1.5 SGE抗凝集活性檢測(cè)

1.5.1血漿制備: 采集健康人靜脈血6 mL, 用 0.109 mol/L枸櫞酸鈉溶液與全血(1∶9)體積比混合抗凝，采集完立即輕柔顛倒混勻。3 000 r/min離心 5 min，取上層血漿，用于活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)檢測(cè)。

1.5.2部分活化凝血酶時(shí)間(APTT)檢測(cè): 按照操作說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，在96孔酶標(biāo)板中每孔加入健康人血漿0.1 mL，然后分別加入終濃度為 1.25、6.25、32.5、62.5 ng/mL SGE 20 μL,對(duì)照組加入等量PBS。加入37℃預(yù)熱的APTT試劑 0.1 mL, 37℃孵育 5 min。最后加入37℃預(yù)熱的 25 mmol/L CaCl2溶液 0.1 mL。記錄出現(xiàn)絲狀纖維或凝固的時(shí)間。

1.5.3凝血酶原時(shí)間(PT)檢測(cè): 按照操作說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，在96孔酶標(biāo)板中每孔加入健康人血漿0.1 mL，然后分別加入終濃度為 1.25、6.25、32.5、62.5 ng/mL SGE 20 μL,對(duì)照組加入等量PBS。37℃孵育 3 min，加入37℃預(yù)溫 PT 試劑 0.2 mL，取一細(xì)針攪拌混合液，記錄出現(xiàn)絲狀纖維時(shí)間或混合液凝固時(shí)間。

1.5.4凝血酶時(shí)間(TT)檢測(cè): 按照操作說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，在96孔酶標(biāo)板中每孔加入健康人血漿0.1 mL，然后分別加入終濃度為 1.25、6.25、32.5、62.5 ng/mL SGE 20 μL,對(duì)照組加入等量PBS。加入 TT 試劑 0.1 mL，取一細(xì)針攪拌混合液。記錄出現(xiàn)絲狀纖維或混合液凝固的時(shí)間。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 SGE對(duì)血小板聚集作用的影響

將低、中、高3個(gè)濃度(0.033、0.1、0.167 μg/μL)SGE與PRP孵育后，加入3種誘導(dǎo)聚集劑，結(jié)果見圖1。低、中與高濃度組SGE作用下，Ⅰ型膠原誘導(dǎo)組的血小板聚集抑制作用顯著(P<0.01)，最高可達(dá)90.36%的聚集抑制率，并顯示出一定的量效關(guān)系；凝血酶誘導(dǎo)組在高濃度SGE作用下血小板聚集即有顯著抑制作用(P<0.05)，聚集抑制率達(dá)50.08%；在3種濃度SGE作用下，ADP誘導(dǎo)組血小板聚集抑制作用不顯著。

圖1 白紋伊蚊雌蚊低、中、高濃度SGE對(duì)3種激活劑誘導(dǎo)下血小板聚集的作用(n=3)Fig.1 Effect of low-, medium-, high-dose SGE of Ae. albopictus female mosquitoes on human platelet aggregation induced by collagen Ⅰ, ADP or thrombin (a: P <0.05).

2.2 抗凝血活性

將不同濃度的白紋伊蚊雌蚊SGE作用于人全血，觀察了SGE對(duì)APTT、PT、TT的影響。如表1所示，隨著SGE濃度的增加，APTT、PT、TT均有延時(shí)效應(yīng)；其中APTT延時(shí)效應(yīng)具有劑量依賴性，但在31.25 ng/mL以上組才有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；TT在1.25 ng/mL組，延時(shí)即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 白紋伊蚊雌蚊不同濃度SGE作用下對(duì)人全血APTT、PT、TT的影響 (n=3)Tab.1 Effect of different concentrations SGE of Ae. albopictus female mosquitoes on human APTT, PT, TT (n=3)

*:P<0.05; **:P<0.01.

3 討論

脊椎動(dòng)物宿主有一個(gè)高度復(fù)雜、冗余、高效的凝血系統(tǒng),主要包括局部血管的收縮、血小板聚集和血液級(jí)聯(lián)凝集。當(dāng)組織受損時(shí)，血小板聚集是避免血液丟失的第一道屏障。Reiberio 等(2000)的研究顯示Ae.aegypti、Anophelesalbimanus和Culexquinquefasciatus雌蚊SGE均可顯著抑制凝血酶、膠原、ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。蚊種不同，針對(duì)不同血小板聚集誘導(dǎo)劑作用的效率也是不同的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低濃度SGE作用下，即可顯著抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，隨著SGE濃度的上升，聚集抑制率顯著上升，最高達(dá)90.36%的抑制效率，有明顯的量效關(guān)系。據(jù)此推測(cè)白紋伊蚊唾液組分內(nèi)可能具有高效的抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的物質(zhì)。事實(shí)上，Aegyptin——某個(gè)分離自Ae.aegypti唾液腺的變應(yīng)原蛋白，可特異性與膠原結(jié)合，抑制血小板粘附、活化、聚集(Calvoetal., 2007，2010)。當(dāng)前已在白紋伊蚊唾液腺內(nèi)克隆并表達(dá)了同源蛋白(李星潘等, 2014)， 至于SGE抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集是否與該蛋白活性相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。本研究中，凝血酶誘導(dǎo)組，高濃度SGE作用才可顯著抑制血小板聚集抑制，抑制率為50.08%，提示白紋伊蚊唾液內(nèi)具有抗凝血酶的物質(zhì)。該研究結(jié)果與Ae.aegyptiSGE 對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率是基本一致的(Reiberio，2000)。Watanabe等(2010)的研究發(fā)現(xiàn)Ae.aegypti唾液內(nèi)有AaT1蛋白，是一種Kazal-type抑制劑，體外具有較弱的凝血酶抑制活性。有趣的是，An.albimanusSGE對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率可高達(dá)100%，同時(shí)在An.albimanus唾液組分內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種蛋白anophelin，具有高效的抗凝血酶作用(Valenzuelaetal., 1999)，作者因此認(rèn)為該蛋白是抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的主要原因(Reiberio，2000)。最近的一項(xiàng)研究顯示按蚊屬蚊蟲均有anophelin的同源蛋白，盡管氨基酸序列一致性低于50%，但是均具有強(qiáng)抗凝血酶的作用(Figueiredoetal., 2012)。ADP是一個(gè)重要的血小板聚集誘導(dǎo)劑，本研究顯示低、中、高濃度SGE作用下，ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制差異并不顯著。這一研究結(jié)果與Reiberio(2000)對(duì)Ae.aegyptiSGE的結(jié)果不一致。當(dāng)前在伊蚊屬、按蚊屬、庫(kù)蚊屬多種蚊蟲體內(nèi)均已分離到Apyrase,該酶主要作用是將ADP水解成磷酸腺苷(AMP)和磷酸根，從而達(dá)到抑制血小板聚集的作用(Champagneetal., 1995; Andradeetal., 2005)；蚊蟲種屬不同，其Apyrase活性是不一樣的，從而表現(xiàn)出來(lái)的ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制效率也是不一樣的(Reiberio，2000)。基于本研究結(jié)果，推測(cè)白紋伊蚊雌蚊SGE內(nèi)的apyrase酶活性可能比較低。

血液級(jí)聯(lián)凝集是脊椎動(dòng)物宿主抗凝血的第3步，包括內(nèi)源性凝集途徑和外源性凝集途徑。通過凝血因子的級(jí)聯(lián)激活，從而最終激活凝血酶原，催化纖維蛋白原分解形成纖維蛋白，加固血小板栓。本研究選擇APTT、PT、TT來(lái)探討SGE 對(duì)血液級(jí)聯(lián)凝集抑制的影響。APTT是部分凝血活酶時(shí)間，可反映血漿中凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ水平,是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)較敏感和常用的篩選實(shí)驗(yàn)因子。PT是血漿凝血酶原時(shí)間，可反映血漿中凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ水平,是外源性凝血系統(tǒng)的篩選檢測(cè)因子。TT則反映血液凝集的最后一步。本研究結(jié)果顯示，SGE可使APTT、PT、TT延時(shí)，說明SGE可作用于血液級(jí)聯(lián)凝集的各個(gè)環(huán)節(jié)，但作用效率有所不同。對(duì)其他吸血昆蟲SGE的抗凝血活性研究也證實(shí)了這一點(diǎn)(Chagasetal., 2010; Borahetal., 2014)。由此可見，吸血已經(jīng)導(dǎo)致昆蟲進(jìn)化了不同的分子參與抵抗宿主的血液凝集反應(yīng)。種類不同，其反應(yīng)的機(jī)制也不盡相同。在Ae.aegypti唾液腺內(nèi)發(fā)現(xiàn)至少2個(gè)蛋白參與這一過程。FXa抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，主要抑制凝血因子X的活化，從而起到抗凝血的作用(Starketal.,1998)；Ae.albopictus唾液腺內(nèi)也分離到FXa 抑制劑的同源蛋白并證實(shí)了其功能，推測(cè)FXa抑制劑參與了SGE的抗凝血功能(Calvoetal., 2011)。此外，AaT1，一個(gè)來(lái)源于Ae.aegypti的對(duì)凝血酶有弱抑制作用的蛋白，可顯著延長(zhǎng)APTT、PT、TT，說明它可能還有其他的功能活性，也參與Ae.aegyptiSGE的抗凝血活性(Watanabeetal., 2010)。

終上，本研究結(jié)果初步顯示白紋伊蚊SGE不僅對(duì)不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集有差異的抑制作用，而且在抗凝血活性也表現(xiàn)了差異，表明SGE是一種具有多種生物學(xué)活性的蛋白組分，不同的組分蛋白針對(duì)脊椎動(dòng)物宿主凝血途徑中的不同環(huán)節(jié)發(fā)揮相同和/不同的作用。然而，由于唾液腺勻漿畢竟是粗蛋白，蛋白混雜，因此本研究結(jié)果是初步的，后續(xù)還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。