張巧，陳春喜，陳振林，周錦菊，段振華，*

（1.賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣西賀州542899；2.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西賀州542899；3.廣西果蔬保鮮和深加工研究人才小高地，廣西賀州542899）

大果山楂是一種藥食兼用的水果，在廣西很多地區(qū)均有種植。與普通山楂相比，大果山楂果粒大，易加工與儲藏，鮮食味道好且營養(yǎng)豐富，其品質(zhì)在全國目前已知的山楂品種中也名列前茅[1-2]。因?yàn)榇蠊介诟兴崽鹩钟欣須饨∑?、消食?dǎo)滯的功能，市場上出現(xiàn)不少以大果山楂為原料的產(chǎn)品，大多是經(jīng)初步加工的產(chǎn)品，如山楂餅、山楂糕、山楂飲料等。但目前市場及學(xué)術(shù)研究中，山楂發(fā)酵制品僅限于酒和醋，對于山楂酵素這種重要的生物發(fā)酵制品，鮮有報道。酵素是由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多種微生物復(fù)合發(fā)酵水果、蔬菜而成的，具有較高的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及超氧化物歧化酶活性的一類生物發(fā)酵制品，因此酵素也稱為酶[3]。酵素在多種微生物的作用下，不僅保存了果蔬原有的營養(yǎng)成分，還能形成一些新的活性成分，增強(qiáng)其營養(yǎng)和保健價值[4]。這些豐富的營養(yǎng)物質(zhì)使得酵素具有消炎抑菌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、保護(hù)肝臟等功效[5-8]。林琳等以人參，靈芝等滋補(bǔ)品開發(fā)的天然酵素，已被證實(shí)具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫力的作用[9]。

酵素在我國的研究起步較晚，天然酵素的開發(fā)和利用目前還位于初步水平，而且功能成分含量并不高，往往無法達(dá)到媒體宣傳的作用。近年來我國學(xué)者開始重視酵素食品的研究，并已取得一些進(jìn)展。但與先進(jìn)國家還存在不少差異，日美等國對酵素食品的研究和開發(fā)十分重視，市面上酵素產(chǎn)品已經(jīng)商業(yè)化，利用酵素產(chǎn)品來加工生產(chǎn)酵素食品也已經(jīng)市場化，但我國還未實(shí)現(xiàn)酵素食品商業(yè)化，因此需要加快對酵素產(chǎn)品的研究。本研究對大果山楂酵素發(fā)酵過程中的某些組分及抗氧化活性的變化規(guī)律進(jìn)行探究，為大果山楂酵素產(chǎn)品的生產(chǎn)和開發(fā)提供一定的技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂，賀州水果建材市場購買；福林酚試劑（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；碳酸鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸鈉、重絡(luò)酸鉀等（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722N可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf公司；恒溫水浴鍋：上海宜昌儀器紗篩廠；電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 大果山楂酵素的制備工藝

大果山楂→洗凈→瀝干→切塊→熱燙→消毒→加糖→自然發(fā)酵→滅菌→酵素

操作要點(diǎn)：將新鮮的大果山楂洗凈后瀝干，切成4塊，去核去梗，沸水中加熱2 min后立即置于冷水冷卻至常溫。山楂塊與紅糖經(jīng)紫外處理45 min進(jìn)行消毒，發(fā)酵罐經(jīng)高壓殺菌（121℃，15 min）使其無菌。將消毒后的山楂裝入發(fā)酵罐，在其上中層分別加入山楂果肉25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的紅糖，密封。發(fā)酵罐置于暗處，室溫（25±1）℃進(jìn)行自然發(fā)酵，發(fā)酵期間定期放氣。在發(fā)酵第 5、10、15、20、25、30、40、55 天分別取得酵素樣液，離心（10 000 r/min，10 min），上清待測。

1.4 pH值的測定

取不同發(fā)酵天數(shù)的酵素樣品上清液5 mL于試管中，采用pH計(jì)測定其pH值。

1.5 總糖的測定

采用3，5-二硝基水楊酸法測定總糖的含量并稍作修改[10]，具體操作為：取1 mL稀釋樣液，加入4 mL 6 mol/L的HCl，沸水加熱15 min，冷卻后用6 mol/L氫氧化鈉溶液中和，蒸餾水定容至100 mL。取水解后的樣液，加入DNS試劑，沸水浴反應(yīng)后測定其540 nm處的吸光值。采用0～1 mg/mL的葡萄糖溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=0.817x-0.012，R2=0.996。根據(jù)回歸方程和樣液的吸光值，測定樣液中總糖（以葡萄糖計(jì)）的含量。

1.6 酒精度的測定

采用比色法測定樣液中的酒精度并稍作修改[11]。具體操作為：取5 mL的稀釋樣液至試管中，加入1 mL 2%重絡(luò)酸鉀溶液，5mL濃硫酸，搖勻，沸水加熱10min，冷卻后測定600 nm下的吸光值。采用0%～0.2%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=2.588x-0.006，R2=0.998。根據(jù)回歸方程和樣液的吸光值，計(jì)算各個樣液的酒精度。

1.7 總酚的測定

總酚含量的測定參照徐輝艷的福林-酚法并稍作修改[12]。采用0～0.02 mg/mL的沒食子酸溶液制備總酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=1.622x-0.009，R2=0.999。根據(jù)沒食子酸的線性回歸方程和樣液的吸光值，測定各個樣液的總酚含量。

1.8 還原力的測定

還原力的測定參照Yildirim等的方法并稍作修改[13]。以蒸餾水調(diào)零，測定各個樣品在700 nm處的吸光值，還原力與吸光值大小成正比。

1.9 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除率的測定參照Blois等的方法[14]。具體操作為：將一定量的稀釋樣液與2×10-4mol/L的DPPH溶液（80%乙醇配制）等體積混合，室溫條件下靜置30 min，以蒸餾水調(diào)零，測定各個樣品在517 nm時的吸光值。DPPH自由基清除率由公式（1）計(jì)算而得。

式中：A1為DPPH溶液與樣品稀釋液的吸光值；A2為樣品稀釋液和80%乙醇的吸光值；A0為DPPH溶液和蒸餾水的吸光值。

1.10 羥基自由基清除能力的測定

羥基自由基清除率的測定參照Liu等[15]的方法。具體操作為：在一定量的待測樣液中，依次加入雙氧水、水楊酸鈉和硫酸亞鐵，混勻，37℃恒溫水浴1 h，以蒸餾水調(diào)零，測定562 nm處的吸光值。羥基自由基清除率由公式（2）計(jì)算而得。

式中：a1為不加樣品的吸光值；a2為加樣品的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 大果山楂酵素發(fā)酵過程中pH值的變化

大果山楂酵素發(fā)酵過程中pH值的變化能反應(yīng)產(chǎn)酸情況以及發(fā)酵是否正常。pH值隨發(fā)酵時間的變化情況見圖1所示。

圖1 大果山楂酵素發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.1 Changes in pH during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

由圖1可知，發(fā)酵前30天，大果山楂酵素液的pH值在 3.14～3.37 范圍內(nèi)變化，發(fā)酵 5 d～10 d 下降，10 d～20 d上升，20 d～30 d再下降，30天后pH值趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵5 d～10 d，發(fā)酵瓶內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡，這是微生物的生長和代謝產(chǎn)生了大量的二氧化碳。由于二氧化碳?xì)馀菰诎l(fā)酵瓶內(nèi)不穩(wěn)定，使得酵素液的pH值上下浮動。30 d后進(jìn)入慢速發(fā)酵階段，pH值趨于穩(wěn)定。

2.2 大果山楂酵素發(fā)酵過程中總糖含量的變化

紅糖是大果山楂酵素的主要原料之一，作為酵素液中微生物的重要碳源，總糖含量的變化是反應(yīng)酵素液中微生物活動情況的指標(biāo)之一[16]。大果山楂酵素發(fā)酵過程中總糖含量的變化情況見圖2所示。

圖2 大果山楂酵素發(fā)酵過程中總糖含量的變化Fig.2 Changes in tatal sugar content during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，大果山楂酵素的總糖含量在發(fā)酵剛開始的前15天有明顯的上升，達(dá)到1.0 g/mL以上，這是由于酵素制備時紅糖采用分層添加的方式，發(fā)酵初期，上層的紅糖還未完全滲入溶液中，隨發(fā)酵時間增加，酵素液的總糖含量會有所提高。發(fā)酵25天后，由于微生物的消耗利用，糖含量迅速下降。發(fā)酵40天后的總糖含量緩慢減少，這是由于微生物活動降低，糖消耗量減少。發(fā)酵55 d時的總糖含量低于0.06 g/mL。

2.3 大果山楂發(fā)酵過程中酒精度的變化

大果山楂果肉及紅糖只經(jīng)過了紫外消毒，而沒有進(jìn)行滅菌，因此山楂果肉及紅糖中仍存留某些微生物，如酵母菌、醋酸菌等。酵母菌在發(fā)酵過程中會利用糖生成乙醇，而醋酸菌能利用乙醇產(chǎn)生醋酸，且乙醇含量影響發(fā)酵飲料的口感，因此發(fā)酵過程中乙醇的變化是一個重要的指標(biāo)之一。大果山楂酵素發(fā)酵過程中酒精度的變化情況見圖3所示。

由圖3可知，在發(fā)酵前20天內(nèi)，酵母菌生長代謝較快，產(chǎn)生大量的乙醇，酵素的酒精度含量在這段時間范圍內(nèi)持續(xù)增加，在20 d達(dá)到最高18.21%vol，之后開始不斷下降。

2.4 大果山楂酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

酚類物質(zhì)是大果山楂的主要活性成分，大果山楂酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化情況見圖4所示。

圖3 大果山楂酵素發(fā)酵過程中酒精度的變化Fig.3 Changes in alcohol content during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

圖4 大果山楂酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.4 Changes in tatal phenols during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

由圖4可以看出，大果山楂酵素總酚含量隨著發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的。發(fā)酵20 d內(nèi)，酵素的總酚含量迅速增加，從1.72 mg/mL上升至最大值7.61 mg/mL；20 d～40 d大果山楂酵素中總酚含量開始持續(xù)下降；40 d后，總酚含量無明顯變化，穩(wěn)定在2 mg/mL左右。發(fā)酵過程中總酚含量的增加與多因素有關(guān)，可能原因是發(fā)酵過程中部分酚類物質(zhì)的持續(xù)溶出，也可能是一些大分子酚類物質(zhì)被微生物利用生成小分子酚類物質(zhì)，使總酚含量增加[17-18]。然而，發(fā)酵20d后，較多的酚類物質(zhì)被不斷氧化和降解，造成其含量的下降。

2.5 大果山楂酵素發(fā)酵過程中還原力的變化

大果山楂中的多酚、黃酮類物質(zhì)使其具有較強(qiáng)的抗氧化活性[19]，大果山楂酵素發(fā)酵過程中還原力的變化情況見圖5所示。

由圖5可知，還原力隨著發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢，發(fā)酵到25 d時的還原力吸光值最高5.082（即還原力最強(qiáng)），25 d后開始下降。還原力的變化趨勢與多酚含量具有一定的相關(guān)性[20]。

2.6 大果山楂酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化

DPPH自由基常用于評價物質(zhì)的抗氧化活性，大果山楂酵素發(fā)酵過程中的DPPH自由基清除率的變化情況見圖6所示。

圖5 大果山楂酵素發(fā)酵過程中還原力的變化Fig.5 Changes in reducing capacity during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

圖6 大果山楂酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化Fig.6 Changes in DPPH radical scavenging ability during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

DPPH自由基清除能力被廣泛地應(yīng)用在評價短時間內(nèi)的抗氧化活性[21]。由圖6可知，大果山楂酵素的DPPH自由基清除率隨著發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢；前20天內(nèi)持續(xù)上升直至最高84.11%，20 d之后一直下降，發(fā)酵55 d時，DPPH清除率比發(fā)酵5 d提高了19.16%。蔣增良研究的葡萄酵素在天然發(fā)酵過程中的DPPH自由基清除率增加了12.5%[22]。酚類物質(zhì)的增加很有可能是DPPH自由基清除能力提高的重要原因。

2.7 大果山楂酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除率的變化

大果山楂酵素發(fā)酵過程中的羥基自由基清除率的變化情況見圖7所示。

由圖7可知，大果山楂酵素的羥基自由基清除率也隨著發(fā)酵時間的增加呈先上升后下降的變化趨勢，在前15天內(nèi)一直上升，且在第15 d至最大值59.57%，之后開始緩慢下降至51.66%左右穩(wěn)定，發(fā)酵第55天，羥基自由基清除率提高了13.36%。

圖7 大果山楂酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除率的變化Fig.7 Changes in hydroxyl radical scavenging ability during fermentation of Malus domeri（Bois）Chev.enzyme drink

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，大果山楂酵素發(fā)酵過程中，發(fā)酵30 d內(nèi)的pH值在3.14～3.37范圍內(nèi)變化，30 d后pH值穩(wěn)定在3.15。總糖含量、酒精度、總酚含量、還原力、DPPH和羥基自由基清除率均呈先升高后降低的趨勢。總糖含量在發(fā)酵20 d達(dá)到最大值1.05 g/mL，55 d后的總糖低于0.06 g/mL；發(fā)酵20 d時的酒精度達(dá)到最高18.21%vol，總酚含量最大值7.61 mg/mL；發(fā)酵25 d時還原力最高；此外，發(fā)酵55 d時的DPPH、羥基自由基清除率分別提高了19.16%、13.36%，大果山楂酵素自然發(fā)酵至15d～25 d時，其抗氧化能力最強(qiáng)。對大果山楂酵素發(fā)酵制備過程中的主要組分及抗氧化活性變化規(guī)律進(jìn)行探究，有利于確定合適的發(fā)酵周期，為大果山楂酵素產(chǎn)品的生產(chǎn)和開發(fā)提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。