（河南科技學(xué)院新科學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

河南省是樹莓（Raspberry）的天然有機場，非常適合樹莓的生長，目前在河南延津建有千畝樹莓基地，是中原地區(qū)特色農(nóng)產(chǎn)品[1]。樹莓是膳食多酚的豐富來源，研究表明日常食用樹莓可以改善血脂異常，抗菌消炎，減少人體和動物慢性疾病的氧化應(yīng)激反應(yīng)[2-6]。樹莓多酚中的花青素在濃度為50 μg/mL能夠抑制脂質(zhì)氧化，抑制率超過50%，在濃度為100 μg/mL時對環(huán)氧化酶的抑制率為27.5%～33.1%[7]，樹莓花青素還具有抑制細(xì)胞毒素形成和體外抗氧化能力，抑制動脈硬化，抑制癌細(xì)胞增殖的能力等功能[8]。Tulio等[9]的研究證明樹莓多酚具有較強的抗菌消炎能力，并對抗癌活性進行了驗證。通過成熟樹莓多酚和其中各單體酚抗氧化能力測定發(fā)現(xiàn)，鞣花酸在樹莓多酚的抗氧化能力中占主要地位，對DPPH·和·OH都有較好的清除作用，清除率分別達到57.82%和74.8%[10-11]。另有學(xué)者研究證明樹莓多酚中的鞣花酸通過抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡途徑治療人體宮頸癌，并取得了顯著的療效[12-13]。

在提取多酚的工藝過程中，超聲波輔助提取、微波輔助提取已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用[14-18]，這兩種方法比直接溶劑萃取的效率有了很大的提升，但是這兩種方法提取溫度高、提取時間長會導(dǎo)致多酚在提取過程中發(fā)生降解。而超聲波-微波協(xié)同提取新技術(shù)合理利用超聲波的空化效應(yīng)和微波高能釋放的熱效應(yīng)，集超聲波微波兩者優(yōu)勢于一體，克服了單獨使用超聲波或微波提取的缺陷，解決了在低溫常壓環(huán)境下，對植物中活性成分的快速、高效提取，且大大降低了目標(biāo)成分被破壞的風(fēng)險[19-22]，目前超聲波微波協(xié)同提取法在樹莓多酚提取方面的研究較少。為了最大化的提取樹莓多酚，在超聲波微波協(xié)同提取時要考慮提取時間，提取溫度，乙醇體積分?jǐn)?shù)，超聲波微波功率等單因素對試驗結(jié)果的影響，并進行條件優(yōu)化，一般來說，優(yōu)化提取工藝可以通過驗證或者統(tǒng)計學(xué)的方法，相比較來說，統(tǒng)計學(xué)方法可以減少試驗次數(shù)并驗證各因素間交互作用，響應(yīng)面法就是一種具有代表性的統(tǒng)計學(xué)方法，已經(jīng)被廣泛在農(nóng)業(yè)和工程方向用于改進、提高和優(yōu)化工藝[23]，但是在超聲波微波協(xié)同提取樹莓多酚方面還沒有應(yīng)用。

本研究以樹莓為原料，利用超聲波微波協(xié)同技術(shù)提取樹莓多酚，采用響應(yīng)面法優(yōu)化樹莓多酚的提取工藝，提高樹莓多酚的提取率，為紅樹莓多酚的進一步研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樹莓：2017年5年采于河南延津樹莓基地，成熟期采摘，采摘后立即儲存在液氮中，后在-80℃冰箱中速凍，冷凍干燥稱粉末，置于-20℃冰箱中保存，使用前解凍。

沒食子酸：Sigma公司；福林酚試劑：北京索萊寶公司；抗壞血酸、檸檬酸、乙醇：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

CW-2000型超聲波-微波協(xié)同萃取儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；UV7500型紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；KQ-100E型超聲波清洗器：上海精密儀器有限公司；DHG-9620A型恒溫干燥箱：上海和呈儀器制造有限公司；SW22型恒溫水浴鍋：德國JULABO公司；JA2003型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用優(yōu)化的福林酚法測定樹莓多酚含量，以沒食子酸為標(biāo)品，分別配成不同濃度加入福林酚試劑，避光條件下，室溫反應(yīng)2 h，在765 nm條件下測定吸光值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.231 1x+0.003 2，R2=0.998 3，y 為 OD765，x 為沒食子酸質(zhì)量濃度。樹莓多酚提取液稀釋至合適濃度，加入福林酚試劑反應(yīng)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出多酚含量。

1.3.2 樹莓多酚提取工藝

在250 mL錐形瓶中加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇100 mL、5 g樹莓凍干粉和1%的抗壞血酸攪拌均勻，置于超聲波微波協(xié)同萃取儀中，在一定功率、溫度和時間條件下萃取，然后將萃取液進行抽濾棄去濾渣，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出多酚含量?？偡雍繂挝挥胢g等量沒食子酸/g干重表示。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 提取時間對樹莓多酚含量的影響

稱取5份5g樹莓凍干粉，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取溫度為30℃，超聲波微波功率300 W條件下，分別提取 10、15、20、25、30min，考察不同提取時間對樹莓多酚含量的影響。

1.3.3.2 提取溫度對樹莓多酚含量的影響

稱取5份5g樹莓凍干粉，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時間為20 min，超聲波微波功率300 W條件下，分別改變提取溫度 20、25、30、35、40 ℃，考察不同提取溫度對樹莓多酚含量的影響。

1.3.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對樹莓多酚含量的影響

稱取5份5 g樹莓凍干粉，在提取時間為20 min，提取溫度為30℃，超聲波微波功率300 W條件下，分別添加體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對樹莓多酚含量的影響。

1.3.3.4 超聲波微波功率對樹莓多酚含量的影響

稱取5份5g樹莓凍干粉，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取溫度為30℃，提取時間為20 min，分別設(shè)定超聲波微波功率 200、250、300、350、400 W，考察不同超聲波微波功率對樹莓多酚含量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計

選取提取時間、提取溫度、乙醇體積、超聲波微波功率4個單因素進行試驗，在此基礎(chǔ)上選擇提取時間、提取溫度和乙醇體積3個對樹莓多酚含量影響顯著的因素，采用Design-Expert8.0建立三因素三水平的Box-Behnken模型，試驗設(shè)計因素編碼水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗測定3次，試驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Design-Expert8.0進行響應(yīng)面設(shè)計和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波超聲波協(xié)同提取樹莓多酚單因素試驗

2.1.1 提取時間對樹莓多酚含量的影響

提取時間對樹莓多酚含量的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取時間對樹莓多酚含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on raspberry polyphenols

當(dāng)提取時間在10 min～20 min時，樹莓多酚的含量隨著提取時間的延長而提高，當(dāng)提取時間超過20 min，樹莓多酚的含量有所下降，這是因為隨著時間的延長，提取出的樹莓多酚部分氧化降低了提取液中樹莓多酚的含量。在提取時間20 min時多酚含量達到最大值75.87 mg/g，因此選擇提取時間為20 min。

2.1.2 提取溫度對樹莓多酚含量的影響

提取溫度對樹莓多酚含量的影響結(jié)果如圖2所示。

當(dāng)提取溫度在20℃～30℃時，樹莓多酚的含量隨著提取溫度的升高而提高，當(dāng)提取溫度超過30℃，樹莓多酚的含量呈現(xiàn)下降趨勢，這是因為隨著溫度的升高，樹莓多酚部分氧化降低了提取液中樹莓多酚的含量。在提取溫度30℃時多酚含量達到最大值75.04 mg/g，因此選擇提取溫度為30℃。

圖2 提取溫度對樹莓多酚含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on raspberry polyphenols

2.1.3 乙醇體積對樹莓多酚含量的影響

乙醇體積對樹莓多酚含量的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對樹莓多酚含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on raspberry polyphenols

當(dāng)乙醇體積低于60%時，樹莓多酚的含量隨著乙醇體積的增加而提高，當(dāng)乙醇體積超過60%，樹莓多酚的含量呈下降趨勢，這是因為在乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，乙醇可以破壞細(xì)胞壁進入細(xì)胞內(nèi)部將酚類物質(zhì)溶出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時，乙醇引起蛋白質(zhì)變性在細(xì)胞壁形成致密結(jié)構(gòu)阻礙酚類物質(zhì)的溶出。在乙醇體積60%時多酚含量達到75.32 mg/g，選擇乙醇體積為60%。

2.1.4 超聲波微波功率對樹莓多酚含量的影響

超聲波微波功率對樹莓多酚含量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲波微波功率對樹莓多酚含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic microwave power on raspberry polyphenols

樹莓多酚的含量隨著超聲波微波功率的提高而緩慢提高，但是經(jīng)過方差分析發(fā)現(xiàn)不同超聲波微波功率條件下的多酚含量沒有顯著性差異（p＜0.05）?？紤]到經(jīng)濟成本選擇超聲波微波功率為300 W，此因素不作為響應(yīng)面試驗的因素。

2.2 模型和方差分析

根據(jù)單因素試驗設(shè)計了因素水平表（表1）進行響應(yīng)面試驗，將每組試驗結(jié)果填入表2，用Design-experts軟件進行方差分析（表3）。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Response surface experiment results

表3 模型方差分析表Table 3 ANOVA of model

通過二次多項回歸分析得到如下回歸方程：

其中Y是響應(yīng)值（樹莓多酚含量），A、B、C分別代表單因素提取時間，提取溫度和乙醇體積3個自變量。

由方差分析表可知模型的F=14.84，p=0.000 9＜0.01，說明總模型極顯著，失擬項F=2.23，p=0.227 3＞0.05，說明失擬項相對于純誤差來說是不顯著的，而模型決定系數(shù)R2=0.950 2表明該模型擬合程度良好，綜合以上結(jié)果表明這個模型方程適合任意變量組合下的多酚預(yù)測。提取時間一次項和二次項、提取溫度二次項極顯著，提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互項、乙醇體積分?jǐn)?shù)二次項顯著。根據(jù)各因素F值可知各因素對樹莓多酚提取影響力的關(guān)系為提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度。

2.3 響應(yīng)面分析

圖5 提取時間和提取溫度對樹莓總多酚影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Effect of extraction time and temperature on total polyphenols from raspberry

響應(yīng)面試驗的自變量交互作用通過三維圖和等高線圖來表示（如圖5～圖7），等高線呈橢圓狀越明顯說明交互作用越顯著，對樹莓多酚含量的影響越顯著，由等高線圖可以看出任意兩因素交互作用的顯著程度，提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用顯著。通過軟件Design-Expert優(yōu)化出的工藝條件是：提取時間21.85 min，提取溫度30.07℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)57.78%，樹莓多酚的含量預(yù)測值為76.77 mg/g。

圖6 提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對樹莓總多酚影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Effects of extraction time and ethanol volume on total polyphenols from raspberry

2.4 驗證試驗

由于工藝參數(shù)有小數(shù)出現(xiàn)，在實際操作中無法控制，所以將優(yōu)化的工藝條件再次優(yōu)化，提取時間22 min，提取溫度30℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在此工藝條件下重復(fù)提取樹莓多酚5次，獲得的樹莓多酚含量（76.85±0.084）mg/g與預(yù)測值非常接近，兩者沒有顯著性差異（p＜0.05），進一步驗證了優(yōu)化的工藝條件的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗，優(yōu)化出超聲波微波協(xié)同提取樹莓多酚的工藝條件為：提取時間22 min，提取溫度30℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在此工藝條件下樹莓多酚含量為（76.85±0.084）mg/g，三因素對響應(yīng)值的主次順序為：提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度，其中提取時間對樹莓多酚含量影響極為顯著。本研究建立的提取工藝提高了樹莓多酚的提取效果，試驗在較低溫度下進行減少了樹莓多酚氧化，極大程度保留樹莓多酚的活性，是一種可廣泛應(yīng)用的樹莓多酚的提取方法，可為樹莓多酚的工業(yè)化生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。