張一帆 魏娜 張飛龍

摘 要：研究建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測青稞中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏馬毒素（FB1）9種生物毒素的方法。樣品采用酸化乙腈溶液提取，以2mmol/L（含0.1%甲酸）乙酸銨-甲醇（70：30，V/V）為流動相，采用正負(fù)離子模式對9種毒素進(jìn)行檢測。結(jié)果回收率在78.6%～113.6%之間。該方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，能滿足我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。

關(guān)鍵詞：青稞；液質(zhì)聯(lián)用；真菌毒素；多組分檢測

中圖分類號：S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180631002

真菌毒素是由曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、鏈格孢屬（Alternaria）等真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，廣泛污染谷物、食品以及飼料等，可致癌、致畸、致突變，威脅人畜健康[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)超過400種真菌毒素，其中黃曲霉毒素（Aflatoxins， AFT）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol， DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone， ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A， OTA）、伏馬毒素（fumonisin， FB）、T-2毒素等是污染谷物的主要真菌毒素，可發(fā)生在作物田間生長階段或收獲后儲藏階段[2，3]。

目前國內(nèi)外檢測真菌毒素的方法主要有薄層層析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法等方法，其中HPLC是國際上檢測真菌毒素最常用的方法[4]。隨著現(xiàn)代分析儀器的發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)廣泛用于玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、伏馬菌素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等真菌毒素檢測 [5-9]。糧食中真菌毒素污染形式往往是多種真菌毒素的共同污染，但目前采用液質(zhì)聯(lián)用檢測真菌毒素的方法多為單組分檢測或同類毒素檢測。液質(zhì)聯(lián)用采用選擇離子監(jiān)測技術(shù)，可大大提高檢測的靈敏度和特異性，前處理技術(shù)可比傳統(tǒng)方法更為簡便，是同時(shí)檢測多種真菌毒素的理想方法。為此本研究利用液相色譜、三重四級桿質(zhì)譜儀聯(lián)用對糧食中多種真菌毒素的檢測技術(shù)進(jìn)行研究，旨在建立多組分準(zhǔn)確、靈敏真菌毒素檢測技術(shù)方法，準(zhǔn)確甄別、掌控糧食中真菌毒素的含量水平，為糧食安全監(jiān)測與評估、食品安全有效監(jiān)管工作提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

色譜純乙腈、色譜純甲醇、色譜純甲酸、分析純冰乙酸。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、OTA、FB1、T-2毒素母液從ROMER公司采購，母液濃度分別為2mg/kg、0.5mg/kg、2mg/kg、0.5mg/kg、100mg/kg、100mg/kg、10mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，在-20℃避光下保存，有效期6個(gè)月。

1.2 儀器與設(shè)備

配有電噴霧（ESI）離子源的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、渦旋混合器、高速離心機(jī)、搖床、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、超聲波清洗儀、資生堂C18色譜柱。

1.3 測定方法

1.3.1 色譜條件

資生堂C18色譜柱（MGⅢ-H，100 mm?2.1 mm， 3μm），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為1μL，流動相A為2mmol/L（含 0.1%甲酸）乙酸銨，B為乙腈（含 0.1% 甲酸）；梯度洗脫程序見表1。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子模式和負(fù)離子模式。選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM），噴霧電壓為5500V，鞘氣為60psi，輔氣為55psi，離子源溫度為550℃。

1.4 樣品前處理方法

1.4.1 樣品提取

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的樣品 5.00g（精確到0.02g）于50mL具塞聚丙烯塑料離心管中，加入10mL水充分浸潤之后，再加入10mL的10：90 甲酸/乙腈，充分振蕩，旋渦。將離心管平置放入搖床，室溫下?lián)u床1h。加入 QuEChERS 鹽包，用手大力振蕩離心管 1min，在8800轉(zhuǎn)/min的速度下，離心5min，取上清液過玻璃微纖維濾紙過濾，收集濾液。

1.4.2 樣品凈化

準(zhǔn)備 PRi MEHLB 小柱（6cc，200mg），無需活化平衡，吸取1mL樣品濾液直接加入SPE小柱，待流干后加入0.5mL乙腈洗脫，吹干，收集全部流出液。

1.4.3 溶劑轉(zhuǎn)換

流出液在40℃下氮?dú)獯抵两?，乙腈水溶液?：1）定容到 1mL，過0.22μm有機(jī)濾膜，上LC-MS/MS 測試。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作

分別吸取不同體積真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)母液，逐級稀釋，用乙腈至刻度線，配制成濃度為含AFB1、AFB2 、AFG1、AFG2、OTA為100μg/kg；含T-2、DON、FB1、ZEN為500μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液后，再用乙腈，分別稀釋配制出6個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液點(diǎn)，避光 -20℃下保存，有效期7d。

分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，5μL、10μL、50μL、100μL、250μL、500μL、1000μL并用50%甲醇溶液（4.6）定容至1mL進(jìn)樣小瓶中，AFB1、AFB2 、AFG1、AFG2、OTA上機(jī)濃度分別為0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，F(xiàn)B1、T-2、ZEN、DON上機(jī)濃度分別為2.5μg/kg、5μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、125μg/kg、250μg/kg、500μg/kg，上機(jī)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件的選擇

2.1.1 色譜條件的選擇

采用MGⅢ-H（100 mm，2.1 mm，3μm）資生堂C18色譜柱對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離，當(dāng)流動相為2mmol/L（含 0.1% 甲酸）乙酸銨溶液-甲醇體積配比為70：30的時(shí)候響應(yīng)值最好。

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)不同真菌毒素的分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)，選擇電噴霧離子源正負(fù)離子掃描模式注射進(jìn)樣，對去簇電壓（DP）、射入電壓（EP）、碰撞電壓（CE）、碰撞室射出電壓（CXP）等條件進(jìn)行優(yōu)化，分別得出不同真菌毒素母離子、子離子和碰撞能量，見表2。

2.2 加標(biāo)回收率

分別稱取3份樣品，每份5.00g，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液50μL（上機(jī)濃度分別為5μg/kg或25μg/kg），按樣品預(yù)處理的方法進(jìn)行提取和凈化后，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定，結(jié)果詳見表3。

2.3 方法精密度

在選定的色譜條件下，在同一天內(nèi)連續(xù)5次測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每次20μL，測定各組分的峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、FB1、T-2、ZEN、DON的RSD分別為1.4%、2.5%、2.8%、3.1%、4.1%、3.6%、2.3%、1.8%、2.6%。連續(xù)5d分別測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每次20μL，測定各組分的峰面積，計(jì)算日間精密度。各真菌毒素的RSD為 3.3%～8.4%。

3 結(jié)論

本方法前處理過程簡單，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，該方法可以一次性分析黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、OTA、FB1、T-2、ZEN等9種真菌毒素，靈敏度、穩(wěn)定性能滿足我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求，為高原糧食中多種真菌毒素的污染定性和定量提供參考依據(jù)。

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作者簡介：魏娜（1983-），女，副研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究。