王燕 張兆輝 陳陽

腦血管病具有較高發(fā)病率、致殘率和病死率的特點，嚴(yán)重危害著人類的健康和生命，目前已經(jīng)成為導(dǎo)致全球人口死亡的第二大病因[1]，其中缺血性腦卒中占60%～80%[2]。但迄今為止，腦卒中后神經(jīng)功能缺損機制尚不明確，因此缺乏針對性的治療措施，缺血性腦損傷是誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡基因表達(dá)最強烈的刺激之一，因此減少缺血性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞成為缺血性腦卒中治療的方法之一。

溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的細(xì)胞間磷脂信號分子，LPA及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮多種作用，參與多種神經(jīng)精神病理過程[3-6]。前期的研究顯示LPA在缺血性腦卒中急性期患者血漿中表達(dá)增多[7-8]；LPA可于體外條件下誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[9]、膠質(zhì)增生[10-11]及破壞血腦屏障[12]，從而參與神經(jīng)血管單元的破壞。但在體內(nèi)環(huán)境中缺血性腦卒中后表達(dá)上調(diào)的LPA對神經(jīng)血管單元的具體功能和作用機制尚不清楚。我們前期工作顯示MCAO大鼠梗死區(qū)LPA1的mRNA水平明顯高于假手術(shù)組，且在術(shù)后48h達(dá)到高峰。因此，本研究選取術(shù)后48h這一時間點，檢測MCAO大鼠腦缺血半暗帶LPA1蛋白的表達(dá)水平，并應(yīng)用LPA1拮抗劑，以初步明確腦缺血后水平升高的LPA1對缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡的作用，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器

實驗對象為SD雄性大鼠，級別為SPF級，體重240～270 g，購于武漢大學(xué)動物實驗中心，線栓購于北京沙東生物技術(shù)有限公司，病理組織切片機購于德國Leitz公司，酶標(biāo)儀購于美國Bio-Tek公司，熒光顯微鏡購于寧波舜宇儀器有限公司，RIPA裂解液購于北京普力萊基因技術(shù)有限公司，BCA試劑盒購于美國Thermo公司，紅四氮唑(TTC) 購于武漢科瑞生物技術(shù)有限公司，Ki16425購于Selleckchem公司，Akt一抗、Phospho-Akt一抗和Caspase-3一抗購于美國Cell Signaling公司，Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購于北京原平皓生物技術(shù)有限公司，兔紅二抗和鼠綠二抗購于谷歌生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型制備

將24只SD雄性大鼠隨機分為4組，每組各6只。A組為假手術(shù)組，B組為MCAO組，C組為MCAO+溶劑對照(Vehicle)組，D組為MCAO+ LPA1抑制劑(Ki16425)組。參照 Zea-Longa 線拴法[13]復(fù)制左側(cè)大腦中動脈閉塞模型。假手術(shù)組將線栓送至目的部位后即刻拔出，其余試驗流程均與手術(shù)組相同。

1.2.2 右側(cè)側(cè)腦室注藥

C、D 2組在拔線栓后分別立即行右側(cè)側(cè)腦室注射10 μl Vehicle(由2 μl DMSO+10 mL PBS配制而成)、10 μl Ki16425(由0.95 mg Ki16425粉末+1 mL DMSO制成2 mM Ki16425，再從上述1 mL混合液中取出2 μl加入10 mL PBS配制而成)。具體方法如下：用10%水合氯醛按0.35 mL/100 g劑量標(biāo)準(zhǔn)麻醉大鼠，俯臥位固定，備皮消毒后在頭頂正中線剪一1 cm左右的切口，分開顱骨上附著的組織，鈍性分離顱頂筋膜，找準(zhǔn)前囟，并標(biāo)記開顱點[14](前囟前0.8 mm，右1.5 mm，深3.5 mm)；用配有合適大小鉆頭的電鉆由標(biāo)記點鉆開顱骨至硬腦膜，用微量注射器針尖緩慢刺破硬腦膜，緩慢下降至3.5 mm，停置2 min后緩緩注藥，觀察48 h后腦組織標(biāo)本做相關(guān)檢測。

1.2.3 大鼠皮層缺血半暗帶蘇木素-伊紅(HE)染色[15]

將石蠟切片脫蠟至水，蘇木素液染核10～15 min，自來水沖洗片刻，用1%鹽酸酒精分化0.5～1 min，流水沖洗片刻至數(shù)小時后用碳酸鋰飽和水溶液反藍(lán)1 min，再次流水沖洗15 min至數(shù)小時；用0.5%伊紅水溶液復(fù)染2～5 min。逐級脫水、透明，晾干后中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 大鼠腦片TTC染色[16]

配制2%TTC染液，將大鼠大腦從前至后均勻切成8片，每片厚度約2 mm；向培養(yǎng)皿中倒入2%TTC染液，使其浸沒腦組織并放入37 ℃恒溫箱中反應(yīng)15～30 min；用生理鹽水將著色好的腦片清洗一遍，倒入4%多聚甲醛至浸沒腦片，并于4 ℃冰箱過夜；用生理鹽水將腦片再次清洗一遍，將腦片按照前后次序依次排列在透明玻璃板上，然后置于掃描儀中進行正反兩面掃描，保存圖像；用Image J軟件來處理計算腦缺血面積。TTC染料使腦片中梗死缺氧部分失染呈白色，未缺氧組織顯示紅色。腦缺血面積用各層腦片前后TTC失染區(qū)的均值之和/所有腦片全腦面積之和來表示。

1.2.5 免疫熒光[17]檢測LPA1表達(dá)水平

將石蠟切片脫蠟至水，EDTA緩沖液中微波修復(fù)；自然冷卻后PBS洗3次，室溫下3%過氧化氫溶液中孵育10 min；用5% BSA中封閉20 min；每張切片滴加50 μL稀釋后的LPA1一抗(1∶200)覆蓋組織，4 ℃過夜；每張切片滴加50～100 μL的抗兔熒光二抗(1∶20 000)，室溫條件下避光孵育50 min～1 h；避光條件下PBS洗3次，每張切片滴加50～100 μL DAPI染核5 min。PBS洗3次，抗熒光淬滅劑封片，4 ℃避光保存，拍照。

1.2.6 免疫組化[18]檢測Caspase-3表達(dá)水平

將石蠟切片脫蠟至水后，進行抗原微波修復(fù)；阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，孵Caspase-3一抗(1∶2 000)，濕盒中4 ℃過夜；PBS洗滌玻片3次，滴加抗兔的二抗(1∶20 000)以覆蓋組織，于室溫下孵育50 min；之后進行DAB顯色，待細(xì)胞染為棕黃色時蒸餾水迅速沖洗，終止顯色；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 Western blotting[19]檢測Caspase-3、p-Akt蛋白表達(dá)水平

按照1 000 μL RIPA/1g腦皮質(zhì)組織的標(biāo)準(zhǔn)加入預(yù)冷的裂解液，用玻璃勻漿器在冰上裂解勻漿30 min，并置于冰上裂解30 min；4 ℃下14 000 r/min離心15 min；離心后取上清，留10 μL用于測定樣品總蛋白水平，剩余上清分裝到0.5 mL的離心管中，加入1/3體積的4×上樣緩沖液煮沸10 min；制備SDS-PAGE凝膠，每孔上樣蛋白20 μg，根據(jù)BCA測得的蛋白水平確定上樣體積，電泳分離，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)轉(zhuǎn)膜90 min，使用TBST清洗PVDF膜后5%脫脂奶粉封閉，室溫水平搖床1 h，再次清洗后用稀釋的兔抗鼠一抗中(Caspase-3，1∶2 000；p-Akt，1∶500；GAPDH，1∶1 000)封閉，放置于4 ℃冰箱中孵育過夜；取出后復(fù)溫30 min，TBST洗膜3次，洗膜后用抗兔熒光二抗(1∶20 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯影，用Image J軟件進行條帶分析。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 A、B 2組大鼠大腦皮層半暗帶的HE染色及2組LPA1的表達(dá)水平

如圖1，經(jīng)過B組(MCAO組)的處理，大鼠大腦皮層缺血再灌注后大腦組織有明顯的損傷，并且經(jīng)過LPA1和Neun免疫雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)LPA1在B組(MCAO組)大鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元上的表達(dá)水平較A組(假手術(shù)組)大鼠相應(yīng)部位明顯增高。

圖1 a和b為A、B 2組大鼠大腦缺血半暗帶HE染色(×400倍),與A組(假手術(shù)組)比較,B組(MCAO組)有明顯的缺血再灌注損傷,表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹,細(xì)胞溶解壞死;c和d為A、B 2組大鼠大腦缺血半暗帶LPA1免疫熒光染色(×400倍);e和f為A、B 2組大鼠大腦皮層半暗帶Neun免疫熒光染色(×400倍);經(jīng)過圖像融合得到g和h(×400倍),LPA1蛋白在B組大鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元上的表達(dá)水平較A組大鼠相應(yīng)部位明顯增高

2.2 C、D 2組TTC染色情況

如圖2，C組(MCAO+溶劑組)和D組(MCAO+LPA1拮抗劑組)腦片均可見蒼白失染的腦梗死區(qū)，而非缺血區(qū)腦組織被染成紅色。與C組(MCAO+溶劑組)比較，D組(MCAO+LPA1拮抗劑組)腦梗死面積明顯增大(P<0.05)。

圖2 C組和D組腦片均可見蒼白失染的腦梗死區(qū),而非缺血區(qū)腦組織被染成紅色 與C組(MCAO+溶劑組)比較,D組(MCAO+LPA1拮抗劑組)腦梗死面積明顯增大*P<0.05

2.3 C、D 2組大鼠皮層缺血半暗帶HE染色及Caspase-3的表達(dá)水平

HE染色顯示，與C組(MCAO+溶劑組)比較，D組(MCAO+溶劑組)細(xì)胞腫脹更加明顯，胞漿空泡區(qū)增大，細(xì)胞核固縮更加嚴(yán)重，細(xì)胞間隙增寬更明顯；免疫組織化學(xué)染色顯示，C組(MCAO+溶劑組)和D組(MCAO+溶劑組)大鼠腦缺血半暗帶細(xì)胞胞漿和胞核中均可見染成棕色或棕褐色的物質(zhì)(即Caspase-3)。與C組(MCAO+溶劑組)比較，D組(MCAO+溶劑組)腦缺血半暗帶Caspase-3蛋白水平明顯增高(圖3)。

2.4 Western blot檢測大鼠大腦皮層組織各分子的表達(dá)水平

與C組(MCAO+溶劑組)比較，D組(MCAO+LPA1拮抗劑組)大鼠腦健側(cè)、半暗帶、缺血核心區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)(圖4)，p-Akt蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)(圖5)。

3 討 論

本研究是在本課題組長期的工作基礎(chǔ)之上進一步探討LPA1的表達(dá)對大鼠局灶性缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的影響，前期研究表明MCAO大鼠梗死區(qū)LPA1的mRNA表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組。本研究通過免疫熒光驗證了MCAO大鼠腦缺血半暗帶LPA1蛋白水平明顯高于對照組。另外，在應(yīng)用LPA1受體拮抗劑后大鼠腦梗死面積較對照組明顯增大，且凋亡蛋白Caspase-3蛋白水平明顯增高；同時發(fā)現(xiàn)p-Akt蛋白水平明顯降低，提示LPA1可能通過Akt信號通路發(fā)揮保護作用。

圖3 a和b分別為C、D 2組的HE染色(×400倍),從圖中可見D組(MCAO+LPA1拮抗劑組)細(xì)胞腫脹更加明顯,胞漿空泡區(qū)增大,細(xì)胞核固縮更加嚴(yán)重,細(xì)胞間隙增寬更明顯;c和d為C、D 2組Caspase-3免疫組織化學(xué)染色(×400倍),從圖中可見與C組(MCAO+溶劑組)比較,D組(MCAO+LPA1拮抗劑組)腦缺血半暗帶Caspase-3蛋白水平明顯增高

圖4 Western blot檢測顯示與C組(MCAO+溶劑組)比較,D組(MCAO+LPA1拮抗劑組)大鼠腦健側(cè)、半暗帶、缺血核心區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高*P<0.05

圖5 Western blot檢測顯示與C組(MCAO+溶劑組)比較,D組(MCAO+LPA1拮抗劑組)大鼠腦健側(cè)、半暗帶、缺血核心區(qū)p-Akt蛋白表達(dá)水平均顯著降低*P<0.05

LPA1是溶血磷脂酸(LPA)受體家族中的一員，目前已有 6 種 G 蛋白偶聯(lián)受體被定義為 LPA 的受體，分別命名為 LPA1-LPA6[20-23]。其中，LPA1可通過不同的信號機制參與缺氧過程。前期研究顯示，在大鼠視網(wǎng)膜缺血模型中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視網(wǎng)膜內(nèi)層上LPA1和LPA2表達(dá)水平上調(diào)，LPA信號傳導(dǎo)增強，以此促進了缺氧條件下視網(wǎng)膜細(xì)胞的存活[24]。然而，在大鼠早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變模型中得出相反的結(jié)論[25]，即當(dāng)LPA1在視網(wǎng)膜組織中上調(diào)時LPA暴露或LPA1過表達(dá)會降低細(xì)胞生存力，而抑制或shRNA敲除LPA1對細(xì)胞存活有益。同時，也有研究表明對LPA1信號通路加以阻斷后胎兒缺氧導(dǎo)致的皮層癥狀[26]也隨之消失。結(jié)合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大鼠MCAO模型中LPA1表達(dá)水平上調(diào)，而對MCAO大鼠給予LPA1拮抗劑后梗死面積明顯增大，細(xì)胞腫脹更加明顯，壞死更加嚴(yán)重，提示LPA1對大鼠缺血半暗帶的細(xì)胞生存具有積極作用。

缺血性腦卒中是腦血流受阻、腦組織缺血缺氧所致的腦損傷，缺血性腦損傷是誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡基因表達(dá)最強烈的刺激之一。Macmanus等[27]首先報道了大鼠腦缺血后半暗帶出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，其在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用。在大鼠MCAO模型中發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予LPA1拮抗劑后Caspase-3的表達(dá)水平明顯增高，反向提示LPA1抑制腦缺血再灌注后神經(jīng)元的凋亡。

本研究觀察到，給予LPA1拮抗劑后p-Akt表達(dá)水平明顯降低。Akt信號通路廣泛存在于各種細(xì)胞中，是膜受體信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝、抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶能力等生物學(xué)作用。因此，本研究推測LPA1可能通過Akt信號通路對缺血再灌注后神經(jīng)元發(fā)揮保護性作用。

綜上所述，大鼠腦缺血再灌注后半暗帶神經(jīng)元上的LPA1蛋白表達(dá)水平上調(diào)，對缺血神經(jīng)元起保護作用，并可能是通過Akt途徑發(fā)揮效應(yīng)的。因此，研究LPA1對缺血神經(jīng)元的保護作用可以為腦梗死的治療提供新的思路。但LPA1對缺血神經(jīng)元的具體保護機制及如何增強這種保護機制，以改善腦梗死后神經(jīng)功能缺損，仍需進一步探索。進一步來說，LPA對神經(jīng)血管單元不同組分是由何種受體類型、通過何種信號途徑、產(chǎn)生何種效應(yīng)，都需進一步的深入研究。