吳 偉 吳曉娟

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，長沙 410004)

稻谷是我國65%以上人口的口糧，稻谷的儲藏和生產(chǎn)直接關(guān)系到國家糧食供應(yīng)體系的安全。早秈稻比中晚秈稻具有更好的耐儲藏性，是南方地區(qū)儲備糧輪換的主要品種。目前，南方地區(qū)的稻米產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到中國稻米產(chǎn)量的50%以上［1］。然而作為“第五、七儲糧生態(tài)區(qū)”的廣大南方地區(qū)，夏季氣溫通常高達(dá)37℃以上、相對濕度高達(dá)85%以上，儲藏過程中稻米極易陳化變質(zhì)［2］。

稻米在陳化過程中稻谷的物理、化學(xué)和生理性質(zhì)發(fā)生一系列變化，導(dǎo)致稻米食用品質(zhì)和使用品質(zhì)下降，最終影響其在市場上的正常流通［3－4］。長期以來，稻米儲藏過程中淀粉和脂質(zhì)含量和結(jié)構(gòu)的變化被視為陳化導(dǎo)致稻米食用品質(zhì)下降的重要原因，近年來相關(guān)研究表明稻米儲藏過程中大米蛋白結(jié)構(gòu)和含量的變化也是導(dǎo)致稻米陳化的主要因素之一［3，5］。已有研究表明，隨著儲藏時間的延長，稻米中的米谷蛋白和醇溶蛋白含量變化不大，清蛋白和球蛋白含量顯著下降［6－7］，但關(guān)于儲藏過程中大米蛋白結(jié)構(gòu)變化的研究報道較少。此外，中國稻米品種繁多，已有研究報道不同品種稻米的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異較大，崔莎莎［8］研究低水解度大米蛋白的結(jié)構(gòu)時，僅發(fā)現(xiàn)β－折疊、無規(guī)卷曲和β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，而缺少α－螺旋結(jié)構(gòu);易翠平等［9－10］研究堿處理和酸法脫酰胺對大米蛋白結(jié)構(gòu)的影響時，僅發(fā)現(xiàn)β－折疊、α－螺旋和β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，而缺少無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。中嘉早17是目前我國年推廣面積最大的秈稻品種［11］。因此，本研究以新收獲秈米中嘉早17為原料，采用溫度37℃、相對濕度85%進(jìn)行加速陳化儲藏，研究儲藏過程中大米蛋白氧化程度及結(jié)構(gòu)的變化，以期為深入探討秈米的陳化機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新收獲秈米中嘉早17(國標(biāo)一級):湖南糧食集團(tuán)長沙儲備分公司;5，5'－二硫代二硝基苯甲酸鹽(DTNB)、1－苯氨基萘 －8－磺酸(ANS):美國Sigma－Aldrich公司;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白:上海生化試劑公司;甘氨酸(Gly)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)等試劑均為分析純:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RXZ－128A型人工氣候箱:寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司;Sorvall LYNX6000型高速冷凍離心機(jī):美國Thermo Fisher公司;LGJ－18型冷凍干燥機(jī):北京四環(huán)科學(xué)有限公司;722s型可見光分光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司;F7000熒光分光光度計:日本日立公司;SE260型電泳儀:美國GE公司;Nano ZS型納米粒度分析儀:英國Malvern公司;IRTracer－100型傅里葉變換紅外光譜儀:日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 秈米加速陳化儲藏

參考王凡等［1］的方法加速陳化儲藏，取適量中嘉早17大米(含水量13.48%)置于15 cm×20 cm大小的托盤中，放入人工氣候箱中加速陳化儲藏，儲藏條件為溫度37℃、相對濕度85%，每周取樣。

1.3.2 大米蛋白制備

參考吳偉等［12］的方法制備大米蛋白，將儲藏不同時間的大米磨粉過80目篩，按料液比1∶7(m/V)加入去離子水中，再用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，在40 ℃、120 r/min下攪拌反應(yīng)4 h，然后將懸浮液在4℃、8 000 r/min下離心20 min，取上清液用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，靜置20 min，4℃、8 000 r/min離心15 min得到蛋白沉淀，用去離子水洗滌3次后，再將蛋白沉淀分散于4倍體積的去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0，透析72 h后冷凍干燥得到純度為82%的大米蛋白。

1.3.3 大米蛋白羰基含量測定

參考Huang等［13］的方法，采用 2，4－二硝基苯肼比色法測定大米蛋白的羰基含量。稱取100 mg左右的大米蛋白分散于5 mL 0.05 mol/L pH 8.0的Tris－HCl緩沖液中，磁力攪拌2 h后在4℃、8 000 r/min下離心30 min，用考馬斯亮藍(lán)比色法測定上清液的蛋白濃度，然后將上清液稀釋為蛋白質(zhì)量濃度2.86 ～4.29 mg/mL 的溶液。用移液管量取0.35 mL該溶液置于離心管中，加入1 mL含10 mmol/L 2，4－二硝基苯肼的2 mol/L鹽酸溶液混合均勻，以不加2，4－二硝基苯肼為空白對照。將混合液在20℃下水浴2 h后，分別加入0.45 mL 40%的三氯乙酸振蕩搖勻，靜置20 min后在4℃、8 000 r/min下離心20 min，棄去上清液，使沉淀懸浮于1.5 mL乙醇－乙酸乙酯(1∶1，V/V)混合液中，在 4 ℃、8 000 r/min 下離心20 min，如此重復(fù)洗滌沉淀3次。最后將蛋白沉淀懸浮于1 mL 0.1 mol/L含6 mol/L鹽酸胍的pH 8.0的Tris－HCl緩沖液中，在37℃下水浴20 min。以空白為對照在367 nm波長校正，以22 000 L/(mol·cm)消光系數(shù)計算每毫克蛋白質(zhì)中羰基衍生物的物質(zhì)的量。

1.3.4 大米蛋白游離巰基及二硫鍵含量測定

參考 Beveridge等［14］的方法，采用 Ellman's試劑比色法測定大米蛋白的巰基和二硫鍵含量。稱取120 mg大米蛋白置于燒杯中，加入20 mL 8 mol/L尿素Tris－Gly溶液(pH為8.0)，室溫磁力攪拌2 h后在4℃、8 000 r/min下離心30 min，用考馬斯亮藍(lán)比色法測定上清液的蛋白濃度。取4 mL上清液加入160μL Ellman's試劑(4 mg DNTB溶于1 mL pH 8.0的Tris－Gly緩沖液)，以不加DNTB為對照，在412 nm波長下測定吸光度，以13 600 L/(mol·cm)消光系數(shù)計算游離巰基含量。另取4 mL上清液加入0.2% β－巰基乙醇處理2 h后，再加入8 mL 12%的三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)1 h，在10 000 r/min下離心10 min，用三氯乙酸溶液重復(fù)洗滌沉淀3次后，將沉淀溶于6 mL Tris－Gly緩沖液中，以不加 DNTB為對照，在412 nm波長下測定吸光度，以13 600 L/(mol·cm)消光系數(shù)計算總巰基含量?？値€基與游離巰基差值的1/2即為二硫鍵含量。

1.3.5 大米蛋白表面疏水性測定

參考Huang等［13］方法，采用ANS熒光探針法測定大米蛋白的表面疏水性。稱取150 mg大米蛋白分散于10 mL 0.05 mol/L pH 8.0 的 Tris－HCl緩沖液中，磁力攪拌2 h后在4℃、8 000 r/min下離心30 min，用考馬斯亮藍(lán)比色法測定上清液的蛋白濃度，然后將上清液稀釋為蛋白質(zhì)量濃度0.005、0.01、0.05、0.20、0.40、0.50 mg/mL 的溶液。取不同蛋白濃度溶液4 mL，分別加入50μL 8 mmol/L ANS溶液，測定熒光強度，激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm。以熒光強度對蛋白質(zhì)濃度作圖，外推至蛋白質(zhì)濃度為0，曲線初始階段的斜率即為大米蛋白的表面疏水性指數(shù)。

1.3.6 大米蛋白傅里葉變換紅外光譜的測定

參考Liu等［15］的方法，稱取1～2 mg大米蛋白和200 mg KBr混合，研磨均勻后制作透明薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描，掃描條件:分辨率4 cm－1，掃描范圍 400 ～4 000 cm－1，每個樣品掃描32次。通過傅里葉紅外解卷積技術(shù)提高分辨率，以Peak fit 4.12軟件對圖譜進(jìn)行分峰處理。

1.3.7 大米蛋白凝膠電泳

參考Huang等［13］的不連續(xù)電泳方法。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，電極緩沖液含0.05 mol/L Tris、0.384 mol/L 甘氨酸、0.1%SDS(pH 8.3)，樣品溶解液含2%SDS、5% β － 巰基乙醇、10%甘油、0.02%溴酚藍(lán)、0.01 mol/L pH 8.0 Tris －HCl緩沖液。電泳樣品質(zhì)量濃度1.5 mg/mL，上樣量10μL，開始電泳時電流為10 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后電流為25 mA。

1.3.8 大米蛋白粒徑測定

將大米蛋白分散于0.05 mol/L pH 8.0的Tris－HCl緩沖液中，制備1 mg/mL蛋白液，采用納米粒度分析儀測定大米蛋白粒徑分布。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

所有實驗平行測定3次。數(shù)據(jù)采用Microsoft excel 2003和Origin 7.5進(jìn)行處理，結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。指標(biāo)比較采用最小顯著差異法，取95%置信度(P ＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米蛋白氧化程度的變化

羰基含量的變化是目前最常用的衡量蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)。如表1所示，秈米中嘉早17加速陳化過程中，大米蛋白羰基含量呈逐漸上升趨勢。第1～6周增加比較緩慢，由初始4.02 nmol/mg上升到4.72 nmol/mg;第 6 ～12 周則顯著增加，由 4.72 nmol/mg上升到8.34 nmol/mg。這可能是由于加速陳化過程中稻米中存在的脂肪氧化酶的同工酶，脂肪氧化酶同工酶可催化亞油酸等脂質(zhì)產(chǎn)生自由基和羰基化合物等活性氧化產(chǎn)物［16］。肉類和大豆蛋白質(zhì)氧化的大量研究表明，脂質(zhì)自由基可通過奪氫、加氧、偶合以及裂解等反應(yīng)，使得蛋白質(zhì)主肽鏈斷裂、側(cè)鏈基團(tuán)氧化以及形成共價交聯(lián)物;脂質(zhì)活性氧化產(chǎn)物可與多肽鏈的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，造成多肽鏈交聯(lián)［17－18］。因而，秈米中嘉早17加速陳化過程中的蛋白質(zhì)氧化程度變化趨勢與油脂氧化自催化反應(yīng)類似，遵循開始緩慢而逐漸加快的變化規(guī)律。

巰基是最容易被自由基攻擊的蛋白質(zhì)氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)［19］。依據(jù)氧化環(huán)境和氧化強度的改變，蛋白質(zhì)巰基可形成二硫鍵和次磺酸等可逆氧化狀態(tài)，也可形成亞磺酸和磺酸等不可逆氧化狀態(tài)［20］。如表1所示，秈米中嘉早17加速陳化過程中，大米蛋白游離巰基含量呈逐漸下降趨勢，而二硫鍵含量無顯著變化。這表明，大米儲藏過程中，其蛋白質(zhì)游離巰基主要發(fā)生的是不可逆氧化反應(yīng)，生成了更多的非二硫鍵共價化合物。

表1 秈米中嘉早17儲藏過程中大米蛋白羰基、游離巰基和二硫鍵含量/nmol/mg

2.2 大米蛋白表面疏水性的變化

表面疏水性反映蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸殘基的相對暴露程度，也可以用它來衡量蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。如圖1所示，第1～10周隨著儲藏時間延長，中嘉早17大米蛋白的表面疏水性逐漸升高;第10～11周，其表面疏水性無顯著變化;第12周，其表面疏水性反而略微下降。前期儲藏過程中表面疏水性升高可能是由于在脂質(zhì)氧化形成的自由基氧化體系中，大米蛋白發(fā)生了去折疊反應(yīng)，使埋藏在蛋白質(zhì)天然構(gòu)象內(nèi)部的脂肪族與芳香族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)等疏水性氨基酸殘基暴露。儲藏后期，大米蛋白表面疏水性不升反降，可能是由于之前暴露的疏水性基團(tuán)進(jìn)一步氧化轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水基團(tuán)，或者是暴露的疏水基團(tuán)通過疏水相互作用形成了聚集體［21］。

圖1 秈米中嘉早17儲藏過程中大米蛋白表面疏水性的變化

2.3 大米蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化

參考Liu等［15］的方法對大米蛋白的去卷積酰胺Ⅰ帶譜峰(如圖2所示)進(jìn)行鑒定，β－折疊結(jié)構(gòu):1 618、1 624、1 630、1 636 和1 684 cm－1;無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu):1 645 cm－1;α－螺旋結(jié)構(gòu):1 655和1 660 cm－1;β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu):1 670和 1 676 cm－1。采用 Peak fit 4.12對酰胺Ⅰ帶圖譜進(jìn)行分峰擬合處理，得到大米蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成(如圖3所示)。隨著中嘉早17儲藏時間的延長，大米蛋白β－折疊結(jié)構(gòu)相對含量顯著降低，無規(guī)卷曲和β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對含量逐漸增加，α－螺旋結(jié)構(gòu)相對含量無顯著變化。有序的β－折疊逐漸向無序的無規(guī)卷曲和β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，這表明秈米中嘉早17加速陳化儲藏導(dǎo)致大米蛋白二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。

圖2 秈米中嘉早17儲藏過程中大米蛋白傅里葉變換紅外光譜酰胺Ⅰ帶

圖3 秈米中嘉早17儲藏過程中大米蛋白二級結(jié)構(gòu)組成的變化

2.4 大米蛋白亞基結(jié)構(gòu)的變化

大米蛋白的主要成分為谷蛋白和醇溶蛋白，其含量占大米蛋白總量的80%以上。醇溶蛋白亞基由單肽鏈通過分子內(nèi)二硫鍵連接而成，其相對分子質(zhì)量在7～12.6 ku之間［22］。相對分子質(zhì)量21 ～22 ku為谷蛋白堿性亞基，34～37 ku為谷蛋白酸性亞基，51 ku為谷蛋白低分子聚肽［23］。如圖4所示，隨著儲藏時間的延長，大米蛋白凝膠電泳圖譜沒有出現(xiàn)新的譜帶，但儲藏10周以后，谷蛋白堿性亞基、谷蛋白酸性亞基帶、谷蛋白低分子聚肽的顏色明顯變淺，而分離膠頂部的顏色逐漸加深。這可能是由于大米蛋白中巰基含量較高，巰基在脂質(zhì)自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的氧化下發(fā)生分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，使谷蛋白形成分子質(zhì)量超過100 ku的聚集體。儲藏12周時大米蛋白氧化聚集體的大量產(chǎn)生，可能正是導(dǎo)致其表面疏水性不升反降的重要原因。而醇溶蛋白亞基帶的顏色則先變淺后變深，這可能是由于較低濃度的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物會誘導(dǎo)醇溶蛋白亞基聚集，但較高濃度的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)組分部分降解［24］。

圖4 秈米中嘉早17儲藏過程中大米蛋白亞基結(jié)構(gòu)的變化

2.5 大米蛋白粒徑分布的變化

中嘉早17儲藏過程中大米蛋白粒徑分布的變化如圖5所示，隨著儲藏時間的延長，大米蛋白粒徑逐漸增加，這表明儲藏過程中大米蛋白形成了可溶性聚集體。吳偉等［25］在儲藏時間對米糠蛋白結(jié)構(gòu)影響的研究中，也發(fā)現(xiàn)隨著儲藏時間的延長米糠球蛋白形成了水溶性聚集體。如前所述，這可能是由于秈米中特有的脂肪氧化酶同工酶催化殘余脂質(zhì)形成了活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，進(jìn)一步誘導(dǎo)大米蛋白氧化形成了聚集體，從而使得粒徑不斷增加。

圖5 秈米中嘉早17儲藏過程中大米蛋白粒徑分布的變化

3 結(jié)論

秈米中嘉早17經(jīng)過為期12周的加速陳化儲藏，制備的大米蛋白發(fā)生了一定程度的氧化和結(jié)構(gòu)變化。儲藏過程中，大米蛋白氧化程度的變化趨勢與油脂氧化自催化反應(yīng)類似，遵循開始緩慢而逐漸加快的變化規(guī)律，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)羰基含量不斷增加，游離巰基含量不斷減少，二硫鍵含量無顯著變化。游離巰基主要發(fā)生的是不可逆氧化反應(yīng)，生成了更多的非二硫鍵共價化合物。同時，大米蛋白表面疏水性則呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢。傅里葉變換紅外光譜分析表明，大米蛋白二級結(jié)構(gòu)中有序的β－折疊逐漸向無序的無規(guī)卷曲和β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致大米蛋白二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。凝膠電泳和粒徑分析結(jié)果均表明，秈米中嘉早17儲藏過程中，蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致大米蛋白形成了氧化聚集體。