趙 艷 史玉倩

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018)

水稻是全球主糧作物之一，轉(zhuǎn)基因(genetically modified，GM)水稻在中國、亞洲和世界上其他地區(qū)都具有潛在重大利益和深遠(yuǎn)影響［1］。隨著轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻“華恢1號”和“Bt汕優(yōu)63”生產(chǎn)應(yīng)用安全證書的頒發(fā)和延期獲準(zhǔn)，有關(guān)GM水稻安全性的爭論日趨激烈。從分子生物學(xué)角度，GM作物除了外源基因編碼產(chǎn)物賦予的可預(yù)期特定遺傳效應(yīng)外，還可能存在其他不可預(yù)期的變異效應(yīng)，簡稱為非預(yù)期效應(yīng)(unintended effects)。GM作物的非預(yù)期效應(yīng)可能改變相關(guān)食品的營養(yǎng)品質(zhì)，甚至產(chǎn)生對人類和動(dòng)物有害的毒素。系統(tǒng)比較研究能為GM作物的非預(yù)期效應(yīng)安全性評估提供重要線索［2］。1993年OECD提出GM食品風(fēng)險(xiǎn)評估的實(shí)質(zhì)等同性原則。2004年OECD建議采用食品關(guān)鍵營養(yǎng)因子和抗?fàn)I養(yǎng)因子對水稻新品種進(jìn)行評估，營養(yǎng)因子包括氨基酸、脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等，抗?fàn)I養(yǎng)因子包括植酸、植物血凝素和胰蛋白酶抑制劑等［3］。油脂是稻米的重要成分，雖然含量不高，如糙米約為3%，精米約為0.8%，糠約為20%，但多為優(yōu)質(zhì)不飽和脂肪酸或淀粉油脂復(fù)合物［4］，不僅營養(yǎng)價(jià)值高，而且與稻米的食用品質(zhì)及陳化劣變密切相關(guān)。分析GM稻米油脂的非預(yù)期效應(yīng)是安全性評估的重要環(huán)節(jié)。Jiao等［5］研究表明與親本相比，轉(zhuǎn)基因水稻種子的主要脂肪酸組分發(fā)生了非預(yù)期變異，其中相對含量的變異幅度為19% ～38%，其中T2的C16∶0降低21%。Choi等［6］發(fā)現(xiàn)與對照相比，轉(zhuǎn) bar基因稻米主要脂肪酸組分未發(fā)生顯著改變，只有稻米油脂中占比極低的C14∶0和C16∶1在含量上發(fā)生了顯著變異。Nam等［7］報(bào)道耐旱轉(zhuǎn)基因稻米和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，硬脂?C18∶0)和鱈油酸(C20∶1)的含量增加。但Wang等［2］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Cry1ab/ac基因水稻種子與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼椭亢椭舅峤M分及含量均沒有顯著差異。前人研究僅采用非轉(zhuǎn)基因親本作為單一對照樣本，即使GM作物品系產(chǎn)生了與親本不等同的非預(yù)期變異，也無法確認(rèn)這種非預(yù)期效應(yīng)是由轉(zhuǎn)基因技術(shù)引發(fā)的?；诖?，我們課題組首次提出了GM農(nóng)作物安全性評價(jià)的PTN(parent control－transgenic plant－nontransgenic control)系統(tǒng)觀念并用于GM水稻種子蛋白質(zhì)組分的非預(yù)期變異分析，即對轉(zhuǎn)基因品系T(transgenic line)依據(jù)“實(shí)質(zhì)等同性”原則進(jìn)行評價(jià)時(shí)，對照樣本中除了常規(guī)親本P(parent line)外，增加遺傳學(xué)背景相關(guān)的非轉(zhuǎn)基因組培再生株系NR(non－transgenic regenerated line)和非轉(zhuǎn)基因遺傳分離陰性后代株系NS(non－transgenic segregated negative offspring line)等遺傳學(xué)對照樣本，經(jīng)過樣本間的多重比對分析，能解析GM品系非預(yù)期效應(yīng)的技術(shù)來源并客觀評價(jià)其安全性［8］。本研究以抗草甘膦GM水稻為材料，根據(jù)PTN系統(tǒng)分析GM稻米油脂含量和脂肪酸組成的非預(yù)期效應(yīng)，為GM水稻的安全性評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

親本材料:粳稻品種日本晴(P1)和PJ574(P2)由中國水稻研究所種質(zhì)創(chuàng)新課題組提供。轉(zhuǎn)2mG2－epsps基因抗草甘膦純合株系T13和T22:分別以P1和P2的成熟胚愈傷組織為受體，利用基因槍介導(dǎo)潔凈DNA轉(zhuǎn)化法將目的基因2mG2－epsps表達(dá)框(包括CaMV35S啟動(dòng)子、2mG2－epsps編碼區(qū)、nos終止子)［9］導(dǎo)入水稻獲得;T13相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因組培株系對照NR13和非轉(zhuǎn)基因陰性分離株系NS13，T22相應(yīng)的對照株系NR22和NS22來源描述參見前期論文［8］。所有水稻材料于12月種植于海南轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)田，次年收獲，水稻種子自然曬干后保存于4℃冰箱備用。

1.2 稻米油脂的提取和定量測定

水稻種子脫殼后磨粉過80目篩，稻米油脂提取按參考文獻(xiàn)［10］。準(zhǔn)確稱取米粉m1(g)到離心管，按料液比1∶3加入正己烷，搖勻振蕩，40℃水浴鍋中浸提15 min，中間顛倒混勻3次。8 000 r/min離心10 min收集上清，重復(fù)提取兩次合并上清，在真空濃縮儀中40℃去除溶劑，干燥2 h至恒重，得油脂稱質(zhì)量m2(g)，置4℃冰箱備用。

油脂含量=m2/m1×100%

油脂含量變異幅度=(水稻樣本T/NR/NS油脂含量－親本P油脂含量)/親本P油脂含量×100%

1.3 稻米脂肪酸組分及含量分析

參照文獻(xiàn)［11－12］進(jìn)行脂肪酸甲酯化。將稻米油脂提取物溶于0.2 mL氯仿:甲醇(2∶1)，加0.3 mL鹽酸甲醇溶液(5%，V/V)，85℃靜置1 h。冷卻至室溫后加1mL正己烷提取2 h，吸取上清進(jìn)行氣相色譜－質(zhì)譜(GC－MS)分析。采用Agilent 7890A－5975C氣相色譜－質(zhì)譜儀，F(xiàn)ID檢測器，HP－INNOWAX毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.5μm)。載氣為高純度He，恒壓模式，壓力為2.047 6 psi;進(jìn)樣口溫度為250℃，進(jìn)樣量1μL，分流比為20∶1。升溫程序:50℃保留1 min，以25℃/min升至200℃，再以3℃/min升溫至230℃，保持23 min。EM電壓為2 094eV，質(zhì)量數(shù)掃描范圍:33～500 amu，離子源溫度為230℃。四級桿溫度為150℃。質(zhì)譜峰識別是利用NIST laboratory標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索和基于標(biāo)樣(FAME Mix，C4－C24)出峰保留時(shí)間，并根據(jù)人工譜圖解析，確定脂肪酸組成，以面積歸一化法計(jì)算各組分的相對含量。

脂肪酸相對含量變異幅度=(水稻樣本T/NR/NS脂肪酸相對含量－親本P脂肪酸相對含量)/親本P脂肪酸相對含量×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果以X±s(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示。分別以P1和P2為對照，應(yīng)用Origin軟件對其他樣本(T、NR、NS)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

采用雙倍單邊檢驗(yàn)(two one－sided tests，TOST)程序［13－14］對樣本間差異進(jìn)行實(shí)質(zhì)等同性判斷。2個(gè)樣本之間置信區(qū)間取90%，即100(1－2×α)%，顯著水平α=0.05，被認(rèn)為2個(gè)樣本存在顯著差異。等同性邊界根據(jù)北歐部長理事會(huì)推薦標(biāo)準(zhǔn)定義為平均數(shù)±20%，變異幅度超過20%即判斷為不等同。

2 結(jié)果

2.1 GM水稻及其多重對照樣本的稻米油脂含量變異分析

T13和T22兩個(gè)GM株系及其相應(yīng)對照樣本的糙米油脂含量比較結(jié)果見表1。所試糙米油脂含量范圍為2.06% ～3.35%，親本品種P2比P1降低了38.51%，差異極顯著，根據(jù)TOST判定二者不等同，說明天然品種差異影響水稻糙米油脂含量。T13和T22的糙米油脂含量與相應(yīng)親本差異極顯著，均不等同，T13比P1降低了21.79%，T22比親本P2增加了20.87%。

表1 轉(zhuǎn)基因水稻與其多重對照樣本糙米油脂含量變異分析

在相同遺傳世代和種植環(huán)境下，GM水稻非預(yù)期效應(yīng)的技術(shù)來源主要包括組織培養(yǎng)無性系變異和外源基因插入突變。NS對照株系在轉(zhuǎn)基因過程中經(jīng)歷的了如下過程:2mG2－epsps基因?qū)爰?xì)胞"2mG2－epsps在姐妹同源染色體整合"草甘膦抗性篩選和植株再生"轉(zhuǎn)基因姐妹染色體的孟德爾遺傳分離"NS株系獲得。該過程中受體細(xì)胞經(jīng)歷了外源基因的導(dǎo)入和分離逸出事件，簡稱為轉(zhuǎn)基因穿梭，與轉(zhuǎn)基因過程密切相關(guān)。因此，NS非預(yù)期效應(yīng)的技術(shù)來源包括組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)和轉(zhuǎn)基因穿梭效應(yīng);NR對照株系的非預(yù)期變異主要由組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)引起，組織培養(yǎng)技術(shù)被認(rèn)為是安全的常規(guī)育種技術(shù)，其無性系變異效應(yīng)無需評估。根據(jù)PTN系統(tǒng)樣本間的多重比較信息(表2)解析GM水稻非預(yù)期效應(yīng)的技術(shù)來源，發(fā)現(xiàn)T22的油脂含量改變趨勢與NR22一致，而且 NR22的油脂含量變異幅度(40.29%)比T22(20.87%)要大，說明 T22油脂含量變異主要來源于轉(zhuǎn)基因過程中的組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)，受外源基因插入突變的影響較小。T13的組培對照株系NR13和親本P2相比油脂含量差異不顯著，說明T13的油脂含量變異可能主要來源于轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)。

2.2 GM稻米脂肪酸組成的變異分析

由于樣品量多，僅將GM水稻T13株系和其親本P1的糙米脂肪酸檢測氣相色譜－質(zhì)譜圖示于圖1。由圖1可知2個(gè)樣本的脂肪酸組分相同，都包括12個(gè)脂肪酸峰，不同樣本出峰時(shí)間在誤差范圍內(nèi)。GM株系T13和非轉(zhuǎn)基因多重對照樣本P1、NR13、NS13相比，糙米脂肪酸組分沒有改變，只是脂肪酸組分的圖譜峰值不完全一致，說明有些組分相對含量存在差異，T22及其對照樣本的分析結(jié)果與此類似。

2.3 GM水稻糙米脂肪酸組分相對含量的變異及技術(shù)來源分析

分別以P1和P2為對照，對各樣本脂肪酸組分的相對含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果匯總于表2和表4，并將各PTN系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)樣本的脂肪酸含量變異趨勢和變異幅度及實(shí)質(zhì)等同性判定結(jié)果分別匯總于表3和表5。表2和表4結(jié)果表明，GM水稻株系與其相應(yīng)的多重對照樣本的脂肪酸組成相同，主要脂肪酸組分為棕櫚酸、油酸和亞油酸，且不飽和脂肪酸含量占70%以上，只是部分脂肪酸相對含量發(fā)生了顯著變異。T13有4種脂肪酸的相對含量與P1差異顯著，而NR13和更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪z傳學(xué)對照樣本NS13分別有5種和7種脂肪酸相對含量與P1差異顯著(表2)，說明糙米脂肪酸組分相對含量的變異效應(yīng)可能受組織培養(yǎng)的影響較大。其次，T13中營養(yǎng)價(jià)值較高的不飽和脂肪酸含量比P1顯著增加，而NR13的不飽和脂肪酸含量顯著降低，可見非預(yù)期變異效應(yīng)也可能改善稻米營養(yǎng)品質(zhì)。

圖1 轉(zhuǎn)基因水稻株系T13與其親本P1糙米脂肪酸氣相色譜－質(zhì)譜圖

表2 轉(zhuǎn)基因水稻T13與其多重對照樣本糙米脂肪酸組分相對含量變異分析/%

表3 轉(zhuǎn)基因水稻T13與其多重對照樣本糙米脂肪酸組分相對含量(%)的變異幅度及實(shí)質(zhì)等同性分析

表3結(jié)果可知，在12種脂肪酸中，按照TOST標(biāo)準(zhǔn)，T13只有亞麻酸的相對含量比 P1增加了23.75%，與P1不等同，而組培對照株系NR13的亞麻酸相對含量的變異幅度(53.20%)更大;T13油酸相對含量比親本P1顯著降低，且變異趨勢與NR13一致，只是NR13的降低幅度(7.08%)顯著大于T13(3.68%)，表明GM株系T13的亞麻酸和油酸相對含量的變異可能主要來源于組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)。同理，可以推測T13的亞油酸和硬脂酸相對含量變異受外源基因插入突變效應(yīng)的影響較大。

由表4可知，T22糙米有10種脂肪酸相對含量與P2差異顯著，NR22和NS22分別也有10種和9種脂肪酸相對含量與P2差異顯著且變異脂肪酸種類基本相同，說明T22糙米脂肪酸相對含量變異主要來源于組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)。就不飽和脂肪酸相對含量而言，T22比P2顯著增加，NR22與P2相似，而NS22也比P2顯著增加，說明轉(zhuǎn)基因過程的穿梭效應(yīng)對提高T22不飽和脂肪酸含量的貢獻(xiàn)較大，組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)的影響較小。

表5顯示T22糙米脂肪酸組分相對含量的變異情況及其與P2的實(shí)質(zhì)等同性分析結(jié)果。在8種不等同組分中，T22花生酸相對含量變異幅度最大。根據(jù)多重對照樣本分析其變異效應(yīng)來源可知，T22的花生酸相對含量比P2增加了約3倍，變異幅度與NS22相似，卻顯著高于NR22(增幅1.84倍)，可見T22花生酸含量變異主要受轉(zhuǎn)基因過程的穿梭效應(yīng)和組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)的雙重影響，受轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)影響很小。同理，T22的棕櫚油酸、油酸、鱈油酸的含量變異效應(yīng)來源與花生酸相似。T22的硬脂酸、亞麻酸和二十二碳烷酸的相對含量與NR22、NS22對照品系之間差異不顯著，變異方向也完全一致，說明其主要來源于組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)，幾乎不受轉(zhuǎn)基因插入效應(yīng)和轉(zhuǎn)基因穿梭效應(yīng)影響。T22的芥酸相對含量與P2實(shí)質(zhì)不等同，然而對照株系NR22和NS22的芥酸含量與P2無顯著差異，由此可推斷該變異主要由轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)引發(fā)。

表4 轉(zhuǎn)基因水稻T22與其多重對照樣本糙米脂肪酸組分相對含量變異分析/%

表5 轉(zhuǎn)基因水稻T22與其多重對照樣本糙米脂肪酸含量(%)變異幅度及實(shí)質(zhì)等同性分析

表6 兩親本品種稻米脂肪酸組分含量(%)的差異比較和實(shí)質(zhì)等同性分析

2.4 GM水稻糙米脂肪酸組分相對含量變異的安全性評價(jià)

兩粳稻親本品種P1和P2的脂肪酸相對含量差異反映水稻天然品系之間的差異，以P1為對照，將P2脂肪酸組分相對含量的變異趨勢和幅度匯總于表6，并根據(jù)TOST判斷其與P1的實(shí)質(zhì)等同性。在12種脂肪酸組分中，有6種脂肪酸組分在P1和P2之間不等同，其中花生酸的含量差異幅度最大，P2比P1降低65.23%。

參照P1和P2之間的差異情況和非預(yù)期效應(yīng)的技術(shù)來源追溯結(jié)果，可分析GM稻米脂肪酸組分非預(yù)期變異的安全性。綜合而言，T13只有亞麻酸的相對含量比P1增加23.75%，低于P1和P2兩親本之間的差異幅度62.87%，說明轉(zhuǎn)基因技術(shù)對GM稻米脂肪酸含量的變異效應(yīng)小于水稻品種天然基因型差異。T22株系8種不等同組分中，亞麻酸相對含量的變異幅度(27.50%)低于P1和P2兩親本之間的差異幅度62.87%，棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、二十二碳烷酸的相對含量變異幅度(23.07% ～56.00%)雖然高于P1和P2之間的差異幅度(12.25%～29.36%)，但仍低于P1和P2兩親本脂肪酸組分相對含量的最大差異幅度65.23%，說明這5種脂肪酸相對含量的變異幅度在安全范圍之內(nèi)。然而T22的其余3種不等同脂肪酸組分的變異安全性值得進(jìn)一步評估，原因在于:花生酸和鱈油酸相對含量的變異幅度(分別為303.34%和124.41%)遠(yuǎn)超出P1和P2之間的最大差異幅度65.23%，且基于PTN系統(tǒng)分析知其變異效應(yīng)包括轉(zhuǎn)基因過程的穿梭效應(yīng);芥酸的相對含量變異幅度雖然低于65.23%，但變異效應(yīng)主要來自轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

“實(shí)質(zhì)等同性”原則被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品的安全性評估。本文基于PTN樣本系統(tǒng)通過分析GM水稻T13、T22與其對照樣本之間的稻米油脂含量及脂肪酸組分差異，追溯非預(yù)期效應(yīng)的技術(shù)來源，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)影響稻米總油脂含量。如T13油脂含量比P1降低了21.79%，T22的油脂含量比P2增加了20.87%，但兩個(gè) GM株系的油脂含量(2.62%和2.49%)仍介于P1(3.35%)和P2(2.06%)之間(表1)。這與前人報(bào)道的結(jié)果類似，即轉(zhuǎn)基因稻米的油脂含量變異幅度低于天然水稻品種之間的差異［2，13］，說明轉(zhuǎn)基因技術(shù)對稻米總油脂含量的非預(yù)期變異效應(yīng)小于天然的水稻品種基因型影響，屬于安全范圍內(nèi)的非預(yù)期變異。分析GM稻米總油脂含量非預(yù)期效應(yīng)的技術(shù)來源(表1)發(fā)現(xiàn)，T13和T22的油脂含量變異主要來源分別為轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)和組織培養(yǎng)無性系變異效應(yīng)，可見不同GM株系非預(yù)期變異效應(yīng)的技術(shù)來源存在差異，原因在于它們分別屬于不同轉(zhuǎn)基因事件，這符合基因槍轉(zhuǎn)化法介導(dǎo)外源基因在受體基因組中隨機(jī)整合的技術(shù)特點(diǎn)。

本研究所有糙米樣本均檢測出12種脂肪酸，主要脂肪酸為棕櫚酸、油酸和亞油酸，且不飽和脂肪酸相對含量在74.16% ～75.60%之間(表2和表4)，與常規(guī)水稻品種的脂肪酸組成分析結(jié)果一致［15］。GM株系T13和T22與各自親本相比，糙米脂肪酸組分種類并未發(fā)生增減，只是某些脂肪酸的相對含量發(fā)生了非預(yù)期變異，這與前人對GM稻米脂肪酸非預(yù)期變異效應(yīng)的研究結(jié)果類似［2，5－6，12，16］。根據(jù) TOST程序判斷，T13只有亞麻酸的相對含量與P1實(shí)質(zhì)不等同，而T22品系有8種脂肪酸組分的相對含量與P2不等同(表3和表5)，說明稻米脂肪酸組分變異在不同GM品系間差異較大，GM作物的安全性評估應(yīng)遵循個(gè)案分析原則。

基于實(shí)質(zhì)等同性原則和TOST評判標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合PTN系統(tǒng)參照樣本的變異效應(yīng)技術(shù)來源追溯結(jié)果，可知GM水稻T22稻米中的花生酸、鱈油酸和芥酸相對含量屬于實(shí)質(zhì)不等同的非預(yù)期變異，變異效應(yīng)來源包括轉(zhuǎn)基因穿梭效應(yīng)和轉(zhuǎn)基因插入突變效應(yīng)，需要進(jìn)一步安全性評估。從食品安全角度，雖然T22稻米花生酸和鱈油酸相對含量與P2相比增加幅度分別高達(dá)303.34%和124.41%，但實(shí)際相對含量只有1.21%和0.86%，而且這兩種脂肪酸都是食品中常見的不限量營養(yǎng)脂肪酸，因此這種變異是安全的。至于芥酸，由于攝入芥酸含量為10% 以上的菜籽油能夠抑制大鼠的生長性能和肝組織長鏈脂肪酸的氧化速率，增加芥酸在不同組織中的累積，并導(dǎo)致心肌脂肪代謝障礙，因此美國FDA規(guī)定芥酸含量不超過2%才被允許添加到成人和兒童食品中，而不允許添加到嬰兒食品中。GB 1536—2004《菜籽油》規(guī)定脂肪酸組成中芥酸含量小于3%為低芥酸菜籽油［17］。根據(jù)糙米油脂含量和芥酸相對含量估算，本文8個(gè)供試樣本的糙米芥酸含量位于0.04%～0.09%之間，遠(yuǎn)低于限量標(biāo)準(zhǔn)，不存在安全風(fēng)險(xiǎn)。T22稻米芥酸相對含量比P2降低了23.69%，該變異對其食用安全性更有利。綜合而言，供試的2個(gè)GM株系稻米油脂含量和組分確實(shí)存在非預(yù)期變異效應(yīng)，會(huì)影響其營養(yǎng)品質(zhì)，但并不存在食品安全隱患。只是GM水稻不同株系間差異較大，安全性評估要嚴(yán)格遵循個(gè)例分析原則。