鄒晉梅

(綿陽市中心醫(yī)院，四川 綿陽 621000)

類風濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細胞(FLS)不僅參與滑膜炎癥，還具有腫瘤細胞樣特征，較正?；ぜ毎哌w移和侵襲力，在類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜增生和組織破壞中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔1〕。Rho激酶(ROCK)是RhoA下游的重要信號蛋白，RhoA/ROCK信號通路具有多種生物學功能，其中包括多腫瘤細胞活性的調(diào)控〔2〕。動物實驗發(fā)現(xiàn)，RhoA、ROCK在類風濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的滑膜中表達水平均明顯提升，并參與滑膜炎癥反應(yīng)〔3〕，但未闡明該信號通路是否調(diào)控FLS的遷移、侵襲、增殖。本研究旨在探討RhoA/ROCK信號通路對類風濕關(guān)節(jié)炎FLS活性的調(diào)控作用。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2017年1～6月綿陽市中心醫(yī)院收治的類風濕關(guān)節(jié)炎患者10例為類風濕關(guān)節(jié)炎組；另取同期行骨關(guān)節(jié)炎患者為骨關(guān)節(jié)炎組和4例無關(guān)節(jié)炎病史外傷者為對照組。入選患者均行關(guān)節(jié)鏡或關(guān)節(jié)置換手術(shù)，本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，簽署知情同意書。

1.2滑膜細胞分離與培養(yǎng) 術(shù)中取患者滑膜組織，無菌條件下移至培養(yǎng)皿中，剪碎后與Ⅰ型膠原酶混合，放入細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)條件下孵育5～8 h。過10 μm孔徑篩網(wǎng)，濾液轉(zhuǎn)至10 ml離心管中，3 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)瓶壁上黏附的FLS。形態(tài)學和免疫組化檢測FLS標志物(CD55、CD106)，鑒定出FLS，繼續(xù)培養(yǎng)3～5代用于實驗。根據(jù)實驗需要，分別用RhoA抑制劑(C3轉(zhuǎn)化酶)和ROCK抑制劑(Y-27632)處理類風濕關(guān)節(jié)炎患者FLS。

1.3FLS總蛋白中RhoA、ROCK活性標志物表達檢測 蛋白質(zhì)提取試劑盒提取FLS總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定濃度。Western印跡檢測RhoA活性標志物(GTP-RhoA)和ROCK活性標志物(磷酸化MYPT1)表達水平。取100 μg總蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，滴加兔抗人RhoA多克隆抗體(1∶300)、兔抗人MYPT1多克隆抗體(1∶500)、兔抗人磷酸化MYPT1多克隆抗體(1∶1 000)，選用兔源性β-actin多克隆抗體(1∶2 000)為內(nèi)參，4℃孵育過夜；洗膜后滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(1∶2 000)，室溫下反應(yīng)1 h。電化學發(fā)光法(ECL)顯色，讀取目標條帶灰度值。

1.4FLS遷移、侵襲、增殖能力檢測 采用趨化性遷移實驗測定FLS遷移能力，密度為6×105的FLS接種到200 μl無血清DEME培養(yǎng)基中，種植到Transwell小室濾網(wǎng)，37℃培養(yǎng)1 h；將含10%FBS DEME培養(yǎng)基加入下室，相同條件培養(yǎng)12 h。按實驗需求，分別用終濃度為10 mg/L的C3轉(zhuǎn)化酶、10 μmol/L的Y-27632預(yù)處理2 h；計數(shù)遷移到下室的細胞數(shù)量。侵襲能力檢測：先用MATRIGEL基質(zhì)包被Transwell小室，之后實驗操作同上。增殖能力檢測：分別用不同濃度的C3轉(zhuǎn)化酶、Y-27632預(yù)處理2 h，之后用10 μg/L的白細胞介素(IL)-1α刺激48 h，MTT法測定FLS增殖能力。

1.5FLS骨架蛋白F-actin表達檢測 用10 mg/L的C3轉(zhuǎn)化酶、10 μmol/L的Y-27632預(yù)處理類風濕關(guān)節(jié)炎患者FLS 2 h，之后用IL-1α刺激12 h。行細胞免疫熒光檢測，將FLS種植于細胞爬片，培養(yǎng)至細胞密度為75%～80%時棄去培養(yǎng)液，甲醛固定細胞，-20℃靜置5 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，分為3組，均滴加IL-1α一抗(1∶50)，另外兩組分別滴加C3轉(zhuǎn)化酶一抗(1∶100)、Y-27632一抗(1∶100)，4℃過夜，滴加熒光Ⅱ抗，室溫下避光靜置1 h，細胞核DAPI染色5 min，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組FLS總蛋白中RhoA、ROCK活性標志物表達情況 類風濕關(guān)節(jié)炎組FLS中GTP-RhoA、總RhoA蛋白相對表達量〔(7.61±1.38)、(5.08±0.75)〕明顯高于骨關(guān)節(jié)炎組〔(3.17±0.52)、(2.38±0.23)〕和對照組〔(3.03±0.39)、(2.15±0.17)〕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。類風濕關(guān)節(jié)炎組磷酸化MYPT1、MYPT1蛋白相對表達量〔(12.95±3.58)、(8.13±1.06)〕明顯高于骨關(guān)節(jié)炎組〔(6.37±0.82)、(5.08±0.47)〕和對照組〔(4.51±0.67)、(5.39±0.53)〕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

1 類風濕關(guān)節(jié)炎組；2 骨關(guān)節(jié)炎組；3 對照組圖1 3組FLS總蛋白中RhoA、ROCK活性標志物檢測

2.2RhoA、ROCK抑制劑對類風濕關(guān)節(jié)炎FLS遷移、侵襲能力的影響 單純FBS組、FBS+C3轉(zhuǎn)化酶組、FBS+Y-27632組遷移細胞數(shù)分別為(81.00±12.00)個、(49.00±14.00)個、(36.00±8.00)個；侵襲實驗顯示，MATRIGEL基質(zhì)細胞數(shù)分別為(58.00±9.00)個、(40.00±9.00)個、(24.00±7.00)個。FBS+C3轉(zhuǎn)化酶組、FBS+Y-27632組遷移細胞數(shù)及MATRIGEL基質(zhì)細胞數(shù)均明顯少于單純FBS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3RhoA、ROCK抑制劑對類風濕關(guān)節(jié)炎FLS增殖的影響 單純IL-1α組吸光度為(1.36±0.28)；不同濃度的C3轉(zhuǎn)化酶(10、20、40、60、80 mg/L)吸光度分別為(1.15±0.31)、(0.76±0.42)、(0.65±0.38)、(0.51±0.31)、(0.47±0.15)；不同濃度Y-27632(10、20、40、60、80 mg/L)吸光度分別為(1.20±0.28)、(1.03±0.20)、(0.82±0.25)、(0.57±0.16)、(0.49±0.11)。與單純IL-1α組相比，當C3轉(zhuǎn)化酶濃度20 mg/L、Y-27632濃度40 mg/L以上時，對類風濕關(guān)節(jié)炎FLS的增殖抑制作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4類風濕關(guān)節(jié)炎FLS骨架蛋白F-actin表達情況檢測 紅色為骨架蛋白F-actin，藍色為細胞核(DAPI)，C3轉(zhuǎn)化酶和Y-27632可顯著抑制類風濕關(guān)節(jié)炎FLS的F-actin聚合。見圖2。

圖2 RhoA、ROCK抑制劑對FLS骨架蛋白F-actin表達的影響(免疫熒光，×100)

3 討 論

類風濕關(guān)節(jié)炎的病理特征包括炎性細胞浸潤、滑膜組織增生、骨質(zhì)破壞等；滑膜細胞異常增殖、活化，表現(xiàn)出侵襲性是類風濕關(guān)節(jié)炎進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔4〕?；罨幕ぜ毎跓o炎性因子等外來刺激時仍能夠保證增殖和侵襲性〔5〕?；ぜ毎掷m(xù)增殖可導致類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織增生變厚，并向關(guān)節(jié)腔轉(zhuǎn)移、侵襲，破壞關(guān)節(jié)軟骨及周圍組織〔6〕。本研究表明，類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞的生物行為已出現(xiàn)異常改變，與正常滑膜細胞存在差異。臨床研究顯示，部分患者即使炎癥得到控制，但關(guān)節(jié)軟骨及周圍組織的破壞仍在繼續(xù)〔7〕，該作用機制目前尚未明確。動物實驗顯示，通過抑制小鼠FLS的遷移、侵襲，可有效控制類風濕關(guān)節(jié)炎病情發(fā)展〔8〕，但調(diào)控機制仍未明確。

細胞的遷移、侵襲是一個復(fù)雜的生理過程，受多種因素調(diào)控。RhoA蛋白為具有多種生物學活性的GTP酶，ROCK是其下游一個關(guān)鍵的信號調(diào)控蛋白，在RhoA活化信息傳導方面具有重要作用。ROCK被RhoA激活后，將MLC酶磷酸化，引發(fā)細胞骨架聚合，增強細胞收縮，促進細胞前移。RhoA、ROCK信號通路在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲方面具有明顯調(diào)控作用，Rho蛋白也可能參與類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制〔9〕。本研究提示RhoA/ROCK信號通路可能參與調(diào)控類風濕關(guān)節(jié)炎FLS的遷移、侵襲。FLS異常增殖也是類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)破壞的因素之一，本研究中RhoA、ROCK特異性抑制劑呈劑量依賴性低抑制FLS增殖。細胞骨架聚合是細胞遷移、侵襲、增殖的關(guān)鍵因素，本研究提示RhoA/ROCK信號通路通過影響細胞骨架聚合來調(diào)控FLS的遷移、侵襲、增殖。