黃玉鈿 陳義忠 鄭 曦 薛玉欽 吳 進(jìn)

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院病理科，福建 福州 350009)

乳腺癌是一種常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國(guó)許多地區(qū)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性健康，乳腺癌發(fā)生發(fā)展的因素機(jī)制尚未完全明確，有研究表明機(jī)體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌器官松果體分泌的褪黑素(MLT)不僅具有抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、調(diào)控機(jī)體免疫等生理功能，其異常分泌與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有密切關(guān)系〔1，2〕。有關(guān)調(diào)節(jié)MLT分泌能否影響乳腺癌進(jìn)展過(guò)程的研究，有利于加深乳腺癌與內(nèi)分泌關(guān)系的認(rèn)識(shí)。本研究通過(guò)建立大鼠乳腺癌荷瘤模型，分析MLT與乳腺癌腫瘤體積、癌細(xì)胞核分裂指數(shù)、Ki67增殖指數(shù)等腫瘤生長(zhǎng)指標(biāo)的關(guān)系，探討MLT對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖水平、腫瘤生長(zhǎng)程度的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物選用和分組 選用清潔級(jí)SD雌性大鼠120只，2月齡，體重(200±10)g，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水，于光照環(huán)境與黑暗環(huán)境下各12 h/d。隨機(jī)平均分成荷瘤對(duì)照組(G組)、荷瘤+生理鹽水組(M0組)、荷瘤+7.5 mg·kg-1·d-1MLT組(M1組)、荷瘤+15 mg·kg-1·d-1MLT組(M2組)。

1.2建立大鼠乳腺癌荷瘤模型 大鼠乳腺癌SHZ-88細(xì)胞株(購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院)傳代培養(yǎng)，SHZ-88乳腺癌細(xì)胞株于25 cm3的培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)基為RPMI1640，含10%胎牛血清，每3天細(xì)胞密集成片時(shí)傳代1次，吸去舊培養(yǎng)基，加磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌貼壁細(xì)胞2次，用0.25%胰酶消化1 min，倒置顯微鏡下觀(guān)察胞質(zhì)縮小、貼壁細(xì)胞分離時(shí)吸去胰酶消化液，加入新培養(yǎng)基并吹打細(xì)胞使其脫壁，混勻后形成細(xì)胞懸液，分裝轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中傳代，加5 ml新培養(yǎng)基至每個(gè)培養(yǎng)瓶中，混勻后置入37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱，傳代細(xì)胞于2 h后開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制作SHZ-88大鼠乳腺癌單細(xì)胞懸液，按5×105個(gè)細(xì)胞/只大鼠對(duì)所有實(shí)驗(yàn)大鼠接種細(xì)胞懸液1次，接種部位為大鼠大腿內(nèi)側(cè)近腹股溝處皮下；從接種當(dāng)日起，每日18∶00按照M0、M1、M2各組補(bǔ)充方案，行腹腔注射生理鹽水或MLT(美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品)1次，連續(xù)注射9 d；接種后第10天荷瘤模型建立成功，接種處可觸及皮下腫塊形成。

1.3測(cè)量乳腺癌腫瘤體積 大鼠乳腺癌細(xì)胞接種后第10天，處死所有荷瘤大鼠，緊貼瘤體完整剝除乳腺癌組織，離體后測(cè)量腫瘤(圖1)，得到腫瘤最長(zhǎng)徑(length)及與最長(zhǎng)徑垂直的最大短徑(width)數(shù)值，腫瘤體積(cm3)=length×width2/2。

圖1 大鼠乳腺癌腫瘤體積、細(xì)胞核分裂象、Ki67表達(dá)

1.4蘇木精-伊紅(HE)染色法 大鼠乳腺癌組織經(jīng)4%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，組織包埋塊以5 μm厚度連續(xù)切片，采用HE染色法處理組織切片。HE染色步驟：切片經(jīng)二甲苯脫蠟，通過(guò)梯度乙醇至水化后，蘇木精液染色8 min，流水沖洗1 min，1%鹽酸-乙醇分化1 s，稍水洗后返藍(lán)，再流水沖洗2 min，0.5%伊紅液染色1 min，稍水洗后梯度乙醇脫水干燥，中性樹(shù)脂封片。顯微鏡下尋找大鼠乳腺癌組織切片中癌細(xì)胞的核分裂象(圖1)，隨機(jī)計(jì)數(shù)30個(gè)高倍視野(HPF，×400倍)中乳腺癌細(xì)胞核分裂總數(shù)，換算成平均每10個(gè)HPF的核分裂數(shù)，作為大鼠乳腺癌細(xì)胞核分裂指數(shù)(個(gè)/10HPF)。

1.5免疫組織化學(xué)法 大鼠乳腺癌石蠟包埋組織切片采用免疫組織化學(xué)Elivision二步法檢測(cè)切片中Ki67表達(dá)，Ki67抗體為兔抗大鼠多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Bio-Techne公司，工作液濃度為1∶100)，免疫組織化學(xué)Elivision試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。檢測(cè)步驟：石蠟包埋組織切片(5 μm厚度)，切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，檸檬酸高壓抗原修復(fù)，待冷卻后加PBS漂洗3次，每次3 min，滴加3%過(guò)氧化氫室溫下反應(yīng)10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS漂洗3次，每次3 min，滴加Ki67一抗，室溫下孵育60 min，PBS漂洗3次，每次3 min，滴加聚合物增強(qiáng)劑(試劑A)，室溫下孵育20 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min，PBS漂洗3次，每次3 min，滴加新配置的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色劑，置于顯微鏡下觀(guān)察控制顯色時(shí)間，著色后蒸餾水沖洗以結(jié)束DAB染色，蘇木精襯染，流水沖洗，梯度乙醇脫水干燥后中性樹(shù)脂封片。同時(shí)檢測(cè)已知陽(yáng)性切片以設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，并采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。Ki67陽(yáng)性表達(dá)于大鼠乳腺癌細(xì)胞核上(圖1)，呈棕黃色，顯微鏡下觀(guān)察每張檢測(cè)切片中熱點(diǎn)區(qū)內(nèi)5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)高倍視野中Ki67陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞數(shù)量/乳腺癌細(xì)胞總數(shù)的比例(%)，取平均值代表大鼠乳腺癌細(xì)胞Ki67增殖指數(shù)(%)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1G組與M0組乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)指標(biāo)比較 G組乳腺癌腫瘤體積與M0組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。G組乳腺癌細(xì)胞核分裂指數(shù)與M0組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。G組乳腺癌Ki67增殖指數(shù)及M0組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2各組乳腺癌腫瘤體積比較 M1組、M2組乳腺癌腫瘤體積與G組和M0組比較均顯著縮小(P<0.05)。M1組與M2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3各組乳腺癌細(xì)胞核分裂指數(shù)比較 M1組、M2組乳腺癌細(xì)胞核分裂指數(shù)與G組和M0組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。M1組與M2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.4各組乳腺癌Ki67增殖指數(shù)比較 M1組、M2組乳腺癌Ki67增殖指數(shù)與G組和M0組比較均顯著減小(P<0.05)，M2組明顯低于M1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組乳腺癌腫瘤體積、細(xì)胞核分裂指數(shù)、Ki67增殖指數(shù)比較

與G組比較：1)P<0.05；與M0組比較：2)P<0.05；與M1組比較：3)P<0.05

3 討 論

MLT化學(xué)名稱(chēng)是N-乙酰-5-甲氧色胺，是一種吲哚類(lèi)激素，最早于1959年在牛的松果體中被發(fā)現(xiàn)，由于青蛙攝食后會(huì)出現(xiàn)蛙皮褪色，故將此激素命名為MLT。機(jī)體內(nèi)的MLT主要由松果體分泌，具有顯著的晝夜節(jié)律性，分泌量峰值出現(xiàn)在夜晚，但夜間的光線(xiàn)照射能使血清MLT的峰值下降甚至分泌完全受抑制〔3〕。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期夜班工作的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于盲人婦女，夜晚工作環(huán)境的光線(xiàn)照射使MLT分泌的晝夜生理節(jié)律破壞、夜間血MLT水平降低，與血中雌激素水平上升及患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的增高關(guān)系密切，在前列腺癌、結(jié)直腸癌患者中也發(fā)現(xiàn)存在血清MLT水平的下降，這些研究提示MLT具有抗腫瘤作用〔4，5〕。MLT的抗癌作用涉及多種途徑且機(jī)制復(fù)雜，除了具有抗雌激素作用，目前研究認(rèn)為還與MLT促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抗氧化、調(diào)控細(xì)胞周期及調(diào)節(jié)免疫等機(jī)制有關(guān)〔6～8〕。

Ki67是一種核蛋白，由MKI-67基因編碼，與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)，其失活使核糖體RNA合成受限，Ki67在細(xì)胞周期的多個(gè)階段均有表達(dá)，包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和細(xì)胞分裂期(M期)，僅在細(xì)胞靜止期(G0期)不表達(dá)，故可作為反映細(xì)胞增殖活躍程度的標(biāo)志物，Ki67增殖指數(shù)的高低與多種惡性腫瘤分化、浸潤(rùn)及預(yù)后等密切相關(guān)〔9，10〕。本研究結(jié)果提示，MLT能延遲或阻留乳腺癌細(xì)胞從G0期到G1期的進(jìn)程，使更多細(xì)胞處于G0期，從而下調(diào)乳腺癌細(xì)胞增殖活性和Ki67增殖指數(shù)；另外，MLT對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖活性的抑制作用具有劑量依賴(lài)性。Liu等〔11〕研究認(rèn)為MLT能調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路，抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(Akt)的磷酸化，下調(diào)細(xì)胞周期素(cyclin)和周期素激酶(CDK)mRNA及蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，引起細(xì)胞周期阻滯從而抑制細(xì)胞增殖。Del Río等〔12〕研究表明MLT還能與鈣調(diào)蛋白(CaM)相結(jié)合，是CaM的內(nèi)源性拮抗劑，具有阻斷GaM-微管蛋白復(fù)合體生成的作用，影響細(xì)胞內(nèi)微管形成，甚至改變微管蛋白的結(jié)構(gòu)從而造成微管破裂，抑制腫瘤細(xì)胞的分裂增殖。此外，Moreira等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，MLT還能上調(diào)促凋亡基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、凋亡相關(guān)因子配體(Fas-L)的表達(dá)，激發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序，進(jìn)一步降低增殖活性。

細(xì)胞周期中的M期即細(xì)胞核分裂期，通過(guò)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞核分裂象得出核分裂指數(shù)，可以反映腫瘤細(xì)胞分裂增殖的活性。本研究結(jié)果提示，補(bǔ)充MLT對(duì)乳腺癌細(xì)胞核分裂水平無(wú)顯著影響，不同于MLT對(duì)Ki67增殖指數(shù)的顯著影響。由于顯微鏡下計(jì)數(shù)的乳腺癌細(xì)胞核分裂象處于細(xì)胞周期的M期，而Ki67陽(yáng)性表達(dá)的癌細(xì)胞不僅包括M期，也包括G1、S、G2等分裂間期的癌細(xì)胞，且M期持續(xù)時(shí)間短，分裂后的細(xì)胞很快轉(zhuǎn)入下一期，鏡下觀(guān)察到的M期癌細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)小于Ki67陽(yáng)性癌細(xì)胞，故核分裂指數(shù)受調(diào)控影響的敏感性低于Ki67增殖指數(shù)。為了具有直觀(guān)體現(xiàn)干預(yù)效果的指標(biāo)以分析MLT對(duì)乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)的影響，本研究除腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)、核分裂指數(shù)等腫瘤生長(zhǎng)微觀(guān)參數(shù)外，還以腫瘤體積作為宏觀(guān)生長(zhǎng)指標(biāo)評(píng)估MLT對(duì)大鼠乳腺癌的影響。本研究結(jié)果從直觀(guān)角度反映出補(bǔ)充MLT能抑制乳腺癌生長(zhǎng)浸潤(rùn)的范圍，與MLT對(duì)乳腺癌細(xì)胞Ki67增殖指數(shù)的影響效果基本一致，表明MLT通過(guò)影響乳腺癌細(xì)胞周期抑制癌細(xì)胞增殖活性，能最終抑制乳腺癌的腫瘤生長(zhǎng)。Jardim-Perassi等〔14〕在人乳腺癌裸鼠移植瘤模型中的研究表明，經(jīng)MLT治療后，乳腺癌腫瘤體積比無(wú)MLT治療的對(duì)照組明顯縮小；對(duì)腫瘤組織的研究表明，MLT治療后的乳腺癌中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)-2表達(dá)及腫瘤間質(zhì)微血管密度均明顯低于對(duì)照組，MLT抑制乳腺癌間質(zhì)微血管生成，降低乳腺癌組織的血液供應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)支持，是拮抗乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)，使腫瘤體積縮小的重要因素。本研究進(jìn)一步增加MLT的補(bǔ)充劑量對(duì)腫瘤體積未見(jiàn)顯著影響，表現(xiàn)在Ki67增殖指數(shù)上的劑量依賴(lài)性未能出現(xiàn)在腫瘤體積指標(biāo)上。而Jardim-Perassi等〔14〕研究則表明增加MLT補(bǔ)充劑量能進(jìn)一步有效降低乳腺癌腫瘤體積，但較大的MLT補(bǔ)充劑量卻導(dǎo)致荷乳腺癌裸鼠出現(xiàn)明顯的體重降低和死亡率上升。有關(guān)MLT補(bǔ)充劑量的研究有待繼續(xù)探討，增加MLT補(bǔ)充劑量對(duì)腫瘤生長(zhǎng)是進(jìn)一步抑制或是產(chǎn)生其他作用尚未明確，根據(jù)療效和副作用選擇合適的補(bǔ)充劑量是MLT治療乳腺癌的重要研究方向。