王幻，王玉濤，陳良，朱思明, *

1(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州,510640) 2(喀什大學 生命與地理科學學院，新疆 喀什,834000) 3(山東奔月生物科技有限公司，山東 東營,257000)

橙皮苷酶(hesperidinase)是一種由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成的復合酶，主要源自青霉[1]和黑曲霉[2]。該酶可催化橙皮苷轉(zhuǎn)化為橙皮素單葡萄糖苷(hesperetin-7-O-glucoside，HMG)和橙皮素。HMG即橙皮素-7-O-葡萄糖苷，分子式為 C22H24O11，是由橙皮苷脫掉1分子鼠李糖后的產(chǎn)物，是橙皮苷/橙皮素衍生物，非糖部分都是橙皮素。HMG水溶性是橙皮苷的50倍，其生物利用度比橙皮苷好。而且，HMG開環(huán)加氫后是一種新型低熱值甜味劑，即葡萄糖基橙皮素二氫查耳酮，故HMG是一種新型甜味劑的前體物質(zhì)[3-4]，這種新型甜味劑具有無毒、低能量、安全等特點，可作為蔗糖的取代物，同時它還有較強的抗感冒病毒活性和抗氧化活性。

目前，HMG的制備方法有化學法[5]和生物轉(zhuǎn)化法[6]?；瘜W法的制備條件難以控制，且目標產(chǎn)物HMG容易進一步水解為橙皮素，從而使得目標產(chǎn)物得率較低，且易對環(huán)境造成嚴重污染；而酶法生物合成的條件溫和，不會引起橙皮苷母核結(jié)構(gòu)的變化。且橙皮苷酶價格便宜，但由于是復合酶，需考慮如何抑制葡萄糖苷酶活性、發(fā)揮鼠李糖苷酶活性，使反應歷程向有利于HMG的方向定向轉(zhuǎn)化；此外，橙皮苷溶解性差，需考慮在酶解體系中進行增溶試驗以提高產(chǎn)物HMG的得率。

本文旨在利用HPLC法測定橙皮苷復合酶的酶學性質(zhì)及其催化路線，由于本文的重點是探討HMG的生成，所以就不考慮β-D-葡萄糖苷酶的作用，注重研究橙皮苷酶及α-L-鼠李糖苷酶的性質(zhì)。并以目標產(chǎn)物的含量及底物轉(zhuǎn)化率為指標，優(yōu)化中間產(chǎn)物HMG的酶解條件，實現(xiàn)橙皮苷向HMG定向轉(zhuǎn)化的調(diào)控，擬解決因橙皮苷水不溶性及復合酶中β-D-葡萄糖苷酶干擾造成的HMG得率低的問題，為甜味劑前體物質(zhì)HMG的定向酶法轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)，有較好的潛在應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙皮苷酶，自制；橙皮苷粗品，由山東奔月生物技術(shù)有限公司提供；橙皮苷、橙皮素單葡萄糖苷及橙皮素標準品，購自美國Sigma公司；乙腈，色譜純；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(LC-100)，上海伍豐儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器(SHA-BA)，金壇市宏華儀器廠；離心機(KA-1000)，上海安亭科學儀器廠；電磁爐(C21-RT2166)，美的生活電器制造有限公司；電子天平(CP224C)，奧豪斯儀器(常州)有限公司；pH計(PHSJ-3F)，上海儀分科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Wondasil C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-甲酸溶液(A：體積分數(shù)為0.1%的甲酸水溶液；B：乙腈)；梯度洗脫程序(0～1 min，85.0% A；1～5 min，85.0% A→75.0% A；5～15 min，75.0% A→60.0% A；15～25 min，60.0% A→50.0% A；25～30 min，50.0% A→85.0% A)；紫外檢測波長：283 nm；反相柱的柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.2 橙皮苷酶活測定方法

采用HPLC法測酶活[7]：錐形瓶中加一定量橙皮苷溶液，置于60 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min水浴搖床中保溫5 min，后加入一定量酶液，繼續(xù)保溫1 h，取出立即用沸水滅活30 min，冷卻后在4 000 r/min下離心20 min，取上清液測定底物剩余量或產(chǎn)物生成量。橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶酶活的確定以橙皮苷的減少量及HMG的生成量為依據(jù)，而β-D-葡萄糖苷酶的酶活以橙皮素的增加量為依據(jù)。

橙皮苷酶酶活的定義：在60 ℃、pH 4.0的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μg橙皮苷或生成1 μg產(chǎn)物所需的酶量為1個酶活單位。

1.3.3 橙皮苷酶對橙皮苷的酶解路線分析

橙皮苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成，其催化路線有2條：(1)橙皮苷先經(jīng)鼠李糖苷酶分解為鼠李糖和HMG，HMG經(jīng)葡萄糖苷酶分解為橙皮素和葡萄糖；(2)橙皮苷先經(jīng)葡萄糖苷酶分解為橙皮素和蕓香糖，蕓香糖再經(jīng)鼠李糖苷酶分解為鼠李糖和葡萄糖。

為確定該復合酶的可能催化路線，將質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的橙皮苷與橙皮苷酶液(12.28 U)在檸檬酸緩沖液pH值4.0和溫度60 ℃的條件下反應150 min。每15 min取樣1次，HPLC法測定不同時間體系中橙皮苷、HMG及橙皮素含量，根據(jù)3種黃酮類物質(zhì)在酶解體系中含量的變化推斷橙皮苷酶的可能催化路線。

1.3.4 橙皮苷酶酶學性質(zhì)研究

1.3.4.1 橙皮苷酶最適反應溫度和熱穩(wěn)定性

將橙皮苷與橙皮苷酶液(12.28 U)在20、30、40、50、60、70、80 ℃的溫度下進行酶反應，緩沖液pH值為4.0，2 h后用HPLC測定橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶(rhamnosidase)的相對酶活，確定其最適反應溫度(相對酶活：設(shè)定最高酶活為100%，其他條件下酶活占最高酶活的百分比)。

將等量橙皮苷酶液(12.28 U)分別在20、30、40、50、60、70、80 ℃的水浴中保溫30、60、90、120、150 min，在酶液中加入橙皮苷溶液，HPLC法測定橙皮苷酶酶活，分析橙皮苷酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.4.2 橙皮苷酶最適反應pH值和酸堿穩(wěn)定性

在最適反應溫度下，將底物與橙皮苷酶液(12.28 U)于pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0的緩沖液中進行酶解反應。酶解體系所用緩沖液為100 mmol/L的HCl-KCl 緩沖液(pH 2.0)、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0、4.0、5.0)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.0、7.0、8.0)和Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)。反應2 h后用HPLC測定橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的相對酶活，確定反應最適pH值。

將橙皮苷酶用上述不同pH值緩沖液混合后置于4 ℃冰箱中分別放置1、2、3、4和5 h后，在最適pH值及溫度下與橙皮苷反應1 h，測定其相對酶活，確定橙皮苷酶的酸堿穩(wěn)定范圍。

1.3.4.3 橙皮苷酶及鼠李糖苷酶反應動力學

取等量的橙皮苷酶液(12.28 U)分別與終質(zhì)量濃度為 20～100 μg/mL的橙皮苷溶液混合，在最適溫度及pH值下反應，每10 min取樣1次，測定橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的反應初速率。以橙皮苷濃度的倒數(shù)為橫坐標，橙皮苷酶和鼠李糖苷酶的反應速率的倒數(shù)為縱坐標，分別繪制橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線，從而計算出米氏常數(shù)Km值和最大反應速度Vmax值。

1.3.5 HMG的酶法生物轉(zhuǎn)化的定向調(diào)控

采取單因素試驗研究橙皮苷酶實現(xiàn)HMG的定向轉(zhuǎn)化調(diào)控。以HMG的生成量及橙皮苷的轉(zhuǎn)化率為指標，考察酶用量(6.14、12.28、15.35和30.7 U)、增溶劑二甲基甲酰胺(DMF)添加量(0.8%、1.6%、3.2%、6.4%和12.8%)、葡萄糖的添加量(0、3、6、9和12 mg/mL)等因素對HMG得率的影響。

融資租賃是一種新的融資方式，對解決投資資金短缺、設(shè)備更新等方面都發(fā)揮著很重要的作用。但受到相關(guān)因素的影響，融資租賃業(yè)發(fā)展還處在一些不足之處，一些優(yōu)勢還未得到有效發(fā)揮。在現(xiàn)在這樣一個經(jīng)濟迅猛發(fā)展的時代，我們應該認識到融資租賃的積極作用，加快融資租賃業(yè)的發(fā)展。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮苷酶酶活測定與酶反應路線分析

對比DAVIS法[8]及對硝基苯酚法[9]，HPLC法[7]可準確地檢測橙皮苷、HMG及橙皮素的含量，分析橙皮苷酶解過程中橙皮苷酶、α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶的酶活。

由酶解體系的液相色譜圖1可得酶解1 h后的橙皮苷、HMG及橙皮素的峰面積，求得體系中橙皮苷、HMG及橙皮素對應的質(zhì)量濃度分別為63.15、10.50和1.65 μg/mL。進而計算橙皮苷酶、α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶的酶活分別為12.28、3.5和0.413 U/g。

圖1 酶解后體系的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of enzymatic hydrolysis system

由1.3.3所述酶解反應的可能路徑，酶解過程中橙皮苷、HMG及橙皮素含量變化情況如圖2所示。

圖2 酶解體系中3種黃酮類物質(zhì)含量的變化Fig.2 Content variations of hesperidin and its hydrolysatein enzymatic hydrolysis system

隨著酶解時間延長，橙皮苷含量逐漸減少，中間產(chǎn)物HMG在短時間內(nèi)含量顯著增加，在1 h后趨近平緩，而橙皮素含量則呈緩慢增加且含量極少?？赏茰y，橙皮苷先在α-L-鼠李糖苷酶作用下生成HMG，且α-L-鼠李糖苷酶的活性較高；隨著反應的進行，中間產(chǎn)物積累的越來越多，使得少量HMG在β-D-葡萄糖苷酶的作用下慢慢酶解生成橙皮素[10]。若以催化路線(2)為主，則反應在短時間內(nèi)應先生成橙皮素，但與事實不符。故可推測橙皮苷復合酶是以催化途徑(1)為主。即底物橙皮苷應先在α-L-鼠李糖苷酶作用下生成HMG，之后β-D-葡萄糖苷酶再將HMG少量酶解成橙皮素。

2.2 橙皮苷酶的酶學性質(zhì)研究

2.2.1 橙皮苷酶的最適反應溫度和熱穩(wěn)定性

從圖3可看出，隨著溫度的升高，橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的酶活均在增加。當溫度在60 ℃時，2種酶的酶活均達到最大值，即酶促反應效果最佳。當溫度大于70 ℃時，橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的酶活顯著下降，相對酶活低于50%，可能是高溫使酶變性，導致酶活逐漸喪失[11]。故60 ℃是橙皮苷酶的最適反應溫度，且橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的最適反應溫度相同，可能原因是α-L-鼠李糖苷酶是橙皮苷酶的限速酶。

圖3 溫度對橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on the activities ofhesperidinase and its α-L-rhamnosidase

從圖4可知，橙皮苷酶在不同溫度下處理一段時間后，隨著處理時間的增加，相對酶活整體呈現(xiàn)下降趨勢。但是在20～70 ℃的溫度范圍內(nèi)，處理時間為150 min時，橙皮苷的相對酶活仍維持在60%以上；且當溫度為60 ℃時，其相對酶活近乎100%；當溫度為20 ℃或70 ℃時，橙皮苷酶的相對酶活有所下降；而當溫度為80 ℃時，橙皮苷酶活的耐熱性急劇下降，相對酶活迅速降低。

圖4 橙皮苷酶酶活的熱穩(wěn)定性Fig.4 Effect of temperature on the thermo-stabilityof the hesperidinase

2.2.2 橙皮苷酶的最適反應pH值和酸堿穩(wěn)定性

圖5 pH值對橙皮苷酶活和α-L-鼠李糖苷酶活的影響Fig.5 Effect of pH on the activities of hesperidinase andits α-L-rhamnosidase

橙皮苷酶在不同pH條件下處理5 h后的酶活如圖6所示，在pH 3.0～7.0的范圍內(nèi)處理5 h后橙皮苷的相對酶活仍保留60%以上；在pH 4.0時，橙皮苷酶酶活基本無變化；在pH 5.0～6.0時，橙皮苷酶相對酶活均保持在80%以上。當pH<3.0或>7.0時，橙皮苷酶的酶活在短時間內(nèi)急劇下降，其最終相對酶活為20%左右。故橙皮苷酶在pH 3.0～7.0的環(huán)境下穩(wěn)定性較好，即橙皮苷酶是嗜酸性酶。

圖6 橙皮苷酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.6 Effect of pH on stability of the hesperidinase

2.2.3 橙皮苷酶和鼠李糖苷酶的酶反應動力學

一般酶解反應過程中底物的減少量與產(chǎn)物的生成量在一段時間內(nèi)是呈線性變化的，其線性變化的斜率即為酶解反應初速度。以橙皮苷濃度的倒數(shù)為橫坐標，以橙皮苷酶或鼠李糖苷酶反應的初速度倒數(shù)為縱坐標，作2種酶的雙倒數(shù)曲線，結(jié)果如圖7所示。橙皮苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的雙倒數(shù)曲線分別為y=340.13x+1.146 4和y=584.49x+2.513 1。計算可得橙皮苷酶的Km值為296.69 μg/mL，Vm值為0.872 3 μg/(mL·min)；α-L-鼠李糖苷酶的Km值為232.58 μg/mL，Vm值為0.397 9 μg/(mL·min)。

圖7 橙皮苷酶及α-L-鼠李糖苷酶的雙倒數(shù)曲線Fig.7 Double reciprocal curves of hesperidase andα-L-rhamnosidase

2.3 HMG定向生物轉(zhuǎn)化的過程調(diào)控

2.3.1 酶用量對HMG定向轉(zhuǎn)化過程的影響

酶添加量與底物濃度的比例對酶解過程有著重要影響。在最適反應溫度60 ℃和pH 4.0下，其他條件均保持一致，改變酶用量，反應5 h。前3 h每隔30 min取樣1次，后2 h每隔1 h取樣1次，測定酶解液中的目標產(chǎn)物HMG的含量及反應底物橙皮苷的轉(zhuǎn)化率隨時間的變化，結(jié)果如圖8所示。

A-HMG含量的變化曲線；B-橙皮苷轉(zhuǎn)化率變化曲線圖8 酶用量對橙皮苷酶解過程的影響Fig.8 Effect of enzyme dosage on the hydrolysis of hesperidin

由圖8可知，隨著酶用量的增加，中間產(chǎn)物HMG的含量和底物橙皮苷的轉(zhuǎn)化率也隨之增加，且HMG含量達到最大值所需時間有所縮短?？赡茉蚴?，在酶解體系中，隨著酶量的增加，體系中橙皮苷酶在一定時間和空間內(nèi)與底物接觸機會增加，即橙皮苷酶催化底物橙皮苷轉(zhuǎn)化的速率變快，故HMG含量達到最大值的時間縮短。對比圖8-A和圖8-B發(fā)現(xiàn)，隨著反應的進行，橙皮苷的轉(zhuǎn)化率一直呈上升趨勢，而HMG含量卻逐漸平穩(wěn)，這是因為隨著HMG含量的積累，雖然有一部分橙皮苷轉(zhuǎn)化成HMG，但同時HMG又少量酶解成橙皮素[13]。從圖中還可看出，當酶用量大于15.35 U時，橙皮苷的轉(zhuǎn)化率增加甚微，且反應至120 min時，中間產(chǎn)物HMG含量達最大值，得率為18.6%。故從節(jié)約成本的角度考慮，最適反應酶用量為15.35 U。

2.3.2 增溶劑二甲基甲酰胺(DMF)添加量對HMG酶法合成的影響

酶解過程往往是在緩沖溶液體系中進行，由于底物橙皮苷是幾乎不溶于水，會影響酶促反應的效率。故考慮在酶解體系中加入增溶劑以促進底物橙皮苷的溶解，使酶解反應順利進行。橙皮苷在常溫下極易溶于DMF溶液，故采用DMF作為底物增溶劑。在酶解溫度為60 ℃、pH值4.0、酶用量為15.35 U的條件下，考察增溶劑添加量對目標產(chǎn)物得率的影響。酶反應5 h，定時取樣測定酶解液中HMG的含量及橙皮苷的轉(zhuǎn)化率隨時間的變化，結(jié)果如圖9所示。

A-HMG生成量的變化曲線；B-橙皮苷轉(zhuǎn)化率變化曲線圖9 DMF添加量對橙皮苷酶解過程的影響Fig.9 Effect of DMF addition on the hydrolysis of hesperidin

由圖9可知，隨著酶解體系中DMF含量的增加，酶解過程的中間產(chǎn)物HMG的含量和底物橙皮苷的轉(zhuǎn)化率均隨之減少，且隨著時間的延長，HMG含量逐漸平穩(wěn)。這是因為在酶解體系中，隨著DMF含量的增加，雖然體系中橙皮苷的溶解度會變大，但DMF同時會抑制橙皮苷酶的酶活[14]，導致橙皮苷的轉(zhuǎn)化率隨著DMF含量的增加而減小，影響HMG的生成，且反應時間為3 h時，得到的中間產(chǎn)物HMG的量基本穩(wěn)定，得率為20.0%。故為得到更多的HMG，選擇增溶劑DMF的添加量越少越好，只需保證其添加量能使橙皮苷較好的溶解即可，本實驗選擇最適DMF的添加量為0.8%。

2.3.3 葡萄糖添加量對HMG制備的影響

橙皮苷酶催化路線主要為(1)，可見中間體HMG的生成與β-D-葡萄糖苷酶也有關(guān)。β-D-葡萄糖苷酶會將得到的HMG繼續(xù)酶解為橙皮素，為提高目標產(chǎn)物HMG含量，考慮在酶解體系中加入一定量的葡萄糖以抑制橙皮苷復合酶中的β-D-葡萄糖苷酶對中間產(chǎn)物的過度酶解[15]。在60 ℃、pH為4.0、酶用量為15.35 U、增溶劑DMF添加量0.8%的酶反應條件下，添加不同量的葡萄糖溶液(圖10)，反應5 h，每隔1 h取樣1次，測定酶解液中的HMG的含量及反應底物橙皮苷的轉(zhuǎn)化率隨時間的變化，結(jié)果如圖10所示。

A-HMG生成量的變化曲線；B-橙皮苷轉(zhuǎn)化率變化曲線圖10 葡萄糖添加量對橙皮苷酶解過程的影響Fig.10 Effect of glucose addition on the hydrolysis ofhesperidin

由圖10可知，未加葡萄糖組的中間產(chǎn)物HMG的含量最少，而此時橙皮苷的轉(zhuǎn)化率卻是最大。原因可能是葡萄糖一方面抑制了β-D-葡萄糖苷酶的酶活使得中間產(chǎn)物HMG沒有向橙皮素方向轉(zhuǎn)化，另一方面葡萄糖的存在引起了產(chǎn)物抑制作用，使得橙皮苷的轉(zhuǎn)化率下降。酶解體系中隨著葡萄糖濃度的增加，酶解過程的中間產(chǎn)物HMG的含量和底物橙皮苷的轉(zhuǎn)化率均隨之減少。這是因為隨著葡萄糖濃度的增加，雖然抑制了體系中得到的HMG進一步酶解為橙皮素，但β-D-葡萄糖苷酶的酶活本身較小，過量的葡萄糖添加量反倒會抑制橙皮苷的酶促反應方向，從而使得中間產(chǎn)物HMG的得率下降。反應3 h時，HMG含量基本穩(wěn)定，最終HMG得率為35.8%，相較于直接反應未加適量增溶劑和葡萄糖苷酶抑制劑條件下得率提高約2倍，且在單位酶活下等量酶液反應所產(chǎn)生的目標產(chǎn)物HMG得率較前人報道的提高了4.7倍[16]，實現(xiàn)目標產(chǎn)物的定向調(diào)控效果。為既能抑制HMG的過度酶解，又能盡量減少對橙皮苷酶的酶活影響，本實驗選擇最適葡萄糖濃度為3 mg/mL。

3 結(jié)論

經(jīng)HPLC法測得的橙皮苷酶、α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶的酶活分別為12.28、3.5和0.413 U/g；酶反應最適溫度為60 ℃，最適pH值4.0，此時橙皮苷酶及α-L-鼠李糖苷酶的動力學常數(shù)Km值分別為296.69 μg/mL和232.58 μg/mL，Vm值分別為0.872 3 μg/(mL·min)和0.397 9 μg/(mL·min)；橙皮苷酶的熱穩(wěn)定性較好，是一種嗜酸性酶，在酸性條件下穩(wěn)定性較高；考慮添加3 mg/mL葡萄糖抑制β-D-葡萄糖苷酶活性，增溶劑DMF添加量為0.8%，可實現(xiàn)橙皮苷向HMG而不是橙皮素的酶法轉(zhuǎn)化的定向調(diào)控；在溫度60 ℃、pH 4.0、酶用量15.35 U、DMF添加量0.8%和葡萄糖添加量3 mg/ml條件下反應3h，HMG最終得率可達35.8%。研究可為高倍查爾酮類甜味劑中間體開發(fā)提供參考，具有潛在應用價值。