薛高瞻，張凱，鄭堯，鄭惠娜，周春霞，高加龍，秦小明，章超樺

(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家貝類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東 湛江，524088)

自2002年以來(lái)，中國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖一直處于世界領(lǐng)先地位[1]。近年來(lái)隨著人工繁殖和工程技術(shù)的不斷發(fā)展，中國(guó)貝類(lèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)量持續(xù)增加。中國(guó)每年生產(chǎn)大約1 200～1 300萬(wàn)t各種貝類(lèi)(約占漁業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的28%)，占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的60%[2-3]。我國(guó)水產(chǎn)品加工仍處于起步階段，特別是貝類(lèi)加工更為落后，即使是生產(chǎn)和出口量較大的主要經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，大多也處于初加工階段，產(chǎn)品形式單一、高附加值產(chǎn)品比例低[4-5]。因此，貝類(lèi)高附加值集約加工和綜合利用問(wèn)題已成為水產(chǎn)貝類(lèi)加工行業(yè)的制約瓶頸。

pH調(diào)節(jié)法提取動(dòng)物蛋白是20世紀(jì)90年代末新興的一種技術(shù)，該方法是利用蛋白質(zhì)在不同pH條件下溶解度不同的原理，首先在堿性條件下將肌肉中的蛋白質(zhì)溶解，去除不溶物，再調(diào) pH至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沉淀蛋白[6]。已有許多研究報(bào)道采用pH調(diào)節(jié)法從魚(yú)肉，雞肉、牛肉、兔肉中有效提取回收高質(zhì)量的蛋白質(zhì)[7-8]。pH調(diào)節(jié)法是一種從動(dòng)植物提取分離蛋白的有效技術(shù)，提取的分離蛋白可作為一種優(yōu)良的膳食補(bǔ)充劑，也可用作生產(chǎn)重組產(chǎn)品的粘合劑、分散劑、乳化劑、即食產(chǎn)品等，同時(shí)其能夠與其他蛋白質(zhì)的相互作用保留凝膠形成能力[9-12]。分離蛋白的組成和特性在食品加工和產(chǎn)品研發(fā)過(guò)程中十分重要[13]。海洋貝類(lèi)是海產(chǎn)蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)。目前，大部分研究主要采用酶解方法[14-15]，采用pH調(diào)節(jié)法制備貝類(lèi)分離蛋白及其組成和特性分析的相關(guān)研究較少。我國(guó)貝類(lèi)蛋白資源豐富，但是加工利用程度低，高附加值產(chǎn)品少。因此，本文采用pH調(diào)節(jié)法從3種經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類(lèi)：扇貝、文蛤和鮑魚(yú)肌肉中提取制備3種貝類(lèi)分離蛋白，確定堿提和酸沉最佳pH，進(jìn)一步分析3種貝類(lèi)分離蛋白的組成和特性，研究結(jié)果為貝類(lèi)分離蛋白作為高品質(zhì)營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)基料應(yīng)用于保健食品生產(chǎn)工業(yè)中提供理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

墨西哥灣扇貝(Argopectenirradiansconcentricus)、文蛤(MeretrixmeretrixLinnaeus)和皺紋盤(pán)鮑(Haliotisdiscushannai)購(gòu)于廣東省湛江市東風(fēng)市場(chǎng)。采用泡沫箱包裝，3種貝類(lèi)鮮活貯運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，立即去殼去內(nèi)臟、清洗干凈，將貝肉分裝于保鮮密封袋中，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司(中國(guó)上海市)；其他化學(xué)品和試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pH-25數(shù)顯pH酸度計(jì)，上海康儀儀器有限公司；UXZ200H島津托盤(pán)電子分析天平，日本島津公司；Milli-Q Biocel超純水系統(tǒng)，美國(guó) Millipore 公司；T18 basic高速分散機(jī)，德國(guó)IKA公司；Sigma 3K3離心機(jī)，德國(guó) Brawn Biotech International公司；日立835-50型高速氨基酸分析儀，日本日立公司；EVO 300 PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司； DYCZ-24 EN電泳槽，北京六一儀器廠(chǎng)；DYY-2C電泳儀，北京六一儀器廠(chǎng)；凝膠成像儀，美國(guó) Bio-Rad公司；204-DSC，德國(guó) Netzsch 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 最佳堿溶及酸沉pH的確定

參考CHEN等[16]提取分離蛋白方法并略加修訂。整個(gè)提取過(guò)程在冰浴中進(jìn)行。首先按1∶3(g∶mL)將貝肌肉分散在預(yù)冷(4 ℃)的超純水中，采用1 mol/L NaOH將溶液的pH分別調(diào)節(jié)至8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和13.0。 然后采用高速均質(zhì)機(jī)，13 000 r/min條件下均質(zhì)3 min，冰浴條件下攪拌30 min后，10 000 r/min，4 ℃離心15min，分別收集沉淀和上清液，上清液用100 mL容量瓶定容后采用Folin-酚蛋白定量試劑盒測(cè)定堿提取液吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(Y=0.001 4X+0.010 1)計(jì)算出蛋白質(zhì)含量，確定最佳堿溶pH值。在最佳堿溶pH條件下提取蛋白溶液，然后分別加入1 mol/L HCl使最佳堿溶上清液的pH分別調(diào)至3.9、4.4、4.5、4.8、5.1、5.4、5.7和6.0保持30 min，然后以10 000 r/min, 4 ℃離心20 min。上清液采用100 mL容量瓶定容，然后采用Folin-酚蛋白定量試劑盒測(cè)定上清液吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出蛋白質(zhì)含量，確定最佳酸沉pH值。最后收集沉淀調(diào)節(jié)pH至中性，冷凍干燥備用。

1.3.2 三種貝類(lèi)分離蛋白的制備

根據(jù)上述3種貝類(lèi)最佳堿溶酸沉pH進(jìn)行SPI、CPI和API的制備，制備工藝流程如下：

貝肌肉→打漿→稱(chēng)量→按1∶3(g∶mL)比例加入預(yù)冷超純水→1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至最佳堿溶pH值 →高速分散機(jī)勻漿3 min(冰浴)→4 ℃下攪拌30 min→10 000 r/min，4 ℃離心15 min→取上清液→ 1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至最佳酸沉pH值→10 000 r/min，4 ℃離心20 min→取沉淀→冷凍干燥→密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分離蛋白基本組成分析

粗蛋白含量測(cè)定，凱氏定氮法GB/T5009.5—2003[17]；水分含量測(cè)定，直接干燥法 GB 5009.3—2010[18]；脂肪含量測(cè)定，索氏抽提法GB/T 5009.6—2003[19]；灰分含量測(cè)定，馬弗爐法GB 5009.4—2010[20]。

1.3.3 分離蛋白溶解性分析

參考ADEBIYI等[21]的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的溶解性。稱(chēng)取3種貝類(lèi)分離蛋白各10 mg分散在10 mL水溶液中，采用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH為2.0～12.0。室溫下磁力攪拌器攪拌20分鐘后，10 000×g離心10 min。 然后采用Folin-酚蛋白定量試劑盒測(cè)定堿提取液吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 分離蛋白DSC分析

參考DA ROCHA等[22]方法并略加修改，將大約10～15 mg的凍干蛋白質(zhì)樣品放置于樣品鋁盤(pán)中，以5 ℃/min的速率從20 ℃加熱至120 ℃測(cè)定樣品DSC曲線(xiàn)，使用密封的空盤(pán)作為參考。

1.3.5 分離蛋白氨基酸組成分析

稱(chēng)取樣品數(shù)毫克，加入2 mL 5.7mol/L HCl，置于110 ℃烘箱內(nèi)水解24 h，然后除去過(guò)量的HCl，加緩沖溶液稀釋到一定體積，搖勻。色氨酸的測(cè)定則采用5 mol/L NaOH進(jìn)行堿水解。采用氨基酸自動(dòng)分析儀分析，上機(jī)條件：流動(dòng)相為專(zhuān)用緩沖液PI-1、2、3、4(分別為Ph 2.2、3.3、4.0、6.4檸檬酸鈉緩沖液)，流速0.225 mL/min，溫度25 ℃，上樣量50 μL[21]。

1.3.6 分離蛋白SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)組成成分測(cè)定；濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，采用R-250考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色檢測(cè)[23]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel(Microsoft Corporation，USA)作圖，SPSS 22.0 (SPSS Inc.，USA) 進(jìn)行方差(ANOVA)顯著性(p<0.05)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳堿溶酸沉pH的確定

大多數(shù)蛋白質(zhì)在中性和堿性pH下帶負(fù)電，通常等電點(diǎn)(pI)在pH 4～6。然而，不同來(lái)源的蛋白質(zhì)可能存在一定差異性[24-27]。為了獲得3種貝類(lèi)肌肉蛋白的最佳堿溶及酸沉pH值，分別在不同堿性pH (9～13)和酸性pH(3.6～5.7)條件下比較了堿性提取液的蛋白提取量和酸沉上清液的蛋白殘留量，見(jiàn)圖1，結(jié)果表明，隨著pH值的增加，3種貝肌肉堿提取液中的蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)，在pH 12和pH 13提取液中蛋白的含量達(dá)到最大值，并且這2種pH條件下，提取液蛋白含量沒(méi)有顯著性差異(p<0.05)，考慮到蛋白質(zhì)變性及堿液的使用量，選擇pH 12為3種分離蛋白提取的最佳堿溶pH，進(jìn)行下一步酸沉實(shí)驗(yàn)。圖1結(jié)果顯示，扇貝和文蛤酸沉上清液中的最低蛋白質(zhì)殘留率均處在pH 4.5～5.1，并且在pH 4.5、4.8和5.1之間沒(méi)有顯著性差異(p<0.05)。鮑魚(yú)酸沉上清液中的最低蛋白質(zhì)殘留率在pH 4.8。因此，扇貝、文蛤和鮑魚(yú)酸沉淀的最適pH分別為5.1、5.1和4.8。

圖1 不同pH條件下3種貝類(lèi)肌肉堿溶蛋白提取量及酸沉蛋白殘留率比較Fig.1 The comparison of protein extraction and residues from three shellfish muscles under different pH conditions注：圖中不同字母標(biāo)注表示具有顯著性差異(p<0.05)。

2.2 SPI、CPI和API的基本組成分析

表1結(jié)果顯示3種貝類(lèi)分離蛋白的基本組成分析，SPI的粗蛋白含量最高，達(dá)到(87.3±2.3)%(干基)，API達(dá)到(86.7±1.4)%(干基)，CPI達(dá)到(80.86±1.7)%(干基)；而CPI的總脂肪含量較高，達(dá)到(8.9±1.3)%(干基)，SPI和API的總脂肪含量較低，分別為(4.5±0.9)% (干基)和(4.8±0.8)%(干基)。3種分離蛋白的灰分含量分別為CPI (5.8±0.6)%(干基)，API (4.5±0.9)%(干基)和SPI (4.0±0.3)%(干基)。研究報(bào)道pH調(diào)節(jié)法提取蛋白可以顯著降低回收蛋白質(zhì)中脂質(zhì)的含量[28-29]。然而，表1結(jié)果顯示，3種貝類(lèi)分離蛋白物中脂質(zhì)的保留率相對(duì)較高。與魚(yú)類(lèi)相比，貝類(lèi)含有較高的磷脂[30]，與羅非魚(yú)分離蛋白相比較，貝類(lèi)分離蛋白的脂肪保留率較高[31]。磷脂由于兩性特征具有乳化作用，與水和蛋白質(zhì)產(chǎn)生相互作用。在蛋白提取過(guò)程中，由于蛋白質(zhì)在接近其等電點(diǎn)的沉淀過(guò)程中重折疊，所以脂質(zhì)可能在酸性pH沉淀期間被包埋在重折疊蛋白的內(nèi)部。

表1 三種貝類(lèi)分離蛋白基本組成分析(n=3)Table 1 Basic composition of the three shellfish proteinisolates (n=3)

注：*表中同一行數(shù)值不同字母標(biāo)注表示具有顯著性差異(p<0.05)，**干基計(jì)。

2.3 SPI、CPI和API的溶解性分析

大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近溶解性最差。蛋白質(zhì)的溶解性對(duì)于其在食品工業(yè)中的應(yīng)用是至關(guān)重要的。因此，圖2比較了pH 2.0～12.0條件下3種貝類(lèi)分離蛋白的溶解性，3種貝類(lèi)分離蛋白均顯示為拋物線(xiàn)形溶解曲線(xiàn)，在pH 4.0～5.5時(shí)溶解性最差，在酸性和堿性pH范圍內(nèi)，pH 2.0和pH 12.0條件下，3種貝類(lèi)分離蛋白分別達(dá)到最大蛋白質(zhì)溶解度。比較這3種貝類(lèi)分離蛋白的溶解性曲線(xiàn)，結(jié)果表明，CPI的溶解性最好。pH調(diào)節(jié)法提取蛋白過(guò)程中，隨著蛋白提取溶液的pH值下降或增加，蛋白凈電荷增加，增強(qiáng)了蛋白靜電排斥從而有利于蛋白質(zhì)不發(fā)生折疊。采用此法回收的水產(chǎn)蛋白表現(xiàn)出表面疏水性和—SH基團(tuán)的增加，從而使提取的分離蛋白溶解性下降。因此，pH調(diào)節(jié)法提取蛋白質(zhì)過(guò)程中，蛋白質(zhì)發(fā)生了pH誘導(dǎo)折疊現(xiàn)象[32]，有研究報(bào)道采用糖基化改性等方法可以改善扇貝分離蛋白的功能特性[33]。

圖2 pH 2.0～12.0 三種貝類(lèi)分離蛋白溶解性比較分析Fig.2 The comparative analysis on solubility of the threeshellfish proteins isolates under pH 2.0-12.0

2.4 SPI、CPI和API的氨基酸組成分析

3種貝類(lèi)分離蛋白的氨基酸組成分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三種貝類(lèi)分離蛋白氨基酸組成分析 n=3 單位：g/100 g(蛋白)

*同一行中不同字母上標(biāo)表示具有顯著性差異(p<0.05).**支鏈氨基酸：異亮氨酸+亮氨酸+纈氨酸

3種貝類(lèi)分離蛋白均富含天冬酰胺和谷氨酸，并且必需氨基酸含量接近(分別為46.22%，45.62%和46.77%)，與相關(guān)魚(yú)類(lèi)分離蛋白研究中報(bào)道的氨基酸組成含量差異不大[31]。根據(jù)FAO/WHO/UNU建議，3種貝類(lèi)分離蛋白中所有必需氨基酸的含量符合成人和嬰兒的氨基酸要求。與推薦的FAO氨基酸模式相比，色氨酸為限制性氨基酸，其次是甲硫氨酸+半胱氨酸和組氨酸。支鏈氨基酸具有獨(dú)特的生理功能，可以消除或減少肝性腦病的癥狀，改善營(yíng)養(yǎng)狀況和疲勞障礙[34]。CPI和API的支鏈氨基酸含量分別為19.33%和19.54%，SPI的支鏈氨基酸水平稍低，為18.76%。

2.5 SPI、CPI和API的DSC熱穩(wěn)定性分析

DSC可用于表征大分子如蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變特性。蛋白質(zhì)的折疊涉及分子內(nèi)作用鍵的破壞，主要是非共價(jià)鍵，蛋白質(zhì)變性及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化在DSC曲線(xiàn)中表現(xiàn)出吸熱過(guò)程[35]。為了驗(yàn)證加熱過(guò)程中3種貝類(lèi)分離蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，對(duì)3種貝類(lèi)分離蛋白進(jìn)行DSC分析。結(jié)果如圖3所示，3種分離蛋白的DSC曲線(xiàn)均顯示了1個(gè)主要的吸熱峰，表明在20～110℃發(fā)生了蛋白質(zhì)變性。API、CPI和 SPI的主要吸熱峰分別集中在63、61和57 ℃。研究結(jié)果表明，SPI在DSC熱分析過(guò)程中比API和CPI更容易展開(kāi)。SPI的較易變性與其蛋白質(zhì)分子中較低的鍵能有關(guān)，這可能是由于pH調(diào)節(jié)過(guò)程中蛋白質(zhì)中高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞引起的，而這種變性與蛋白質(zhì)分子的解折疊或聚集的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[36]。

圖3 三種貝類(lèi)分離蛋白DSC分析曲線(xiàn)Fig.3 DSC analysis curves of the three shellfish protein isolates

2.6 SPI、CPI和API的SDS-PAGE分析

通過(guò)SDS-PAGE分析3種貝類(lèi)分離蛋白蛋白質(zhì)組成，同時(shí)比較了經(jīng)過(guò)β-巰基乙醇還原處理與未經(jīng)過(guò)β-巰基乙醇還原處理的樣品組成差異，結(jié)果見(jiàn)圖4，未經(jīng)β-巰基乙醇處理樣品，3種貝類(lèi)分離蛋白條帶主要集中在4個(gè)范圍(200,97,44和38 kDa)，而經(jīng)β-巰基乙醇處理樣品，主要集中在200,97,44,38和18 kDa，其中97kDa和44 kDa條帶由于β-巰基乙醇處理，使蛋白質(zhì)二硫鍵的減少而有所增加。大多數(shù)水溶性蛋白質(zhì)在酸沉處理過(guò)程中被去除，因此，pH調(diào)節(jié)法所獲得的分離蛋白主要由肌原纖維蛋白組成。肌原纖維蛋白質(zhì)由肌球蛋白重鏈(MHC)、輕鏈、肌動(dòng)蛋白和α-輔肌動(dòng)蛋白等組成。MHC和肌動(dòng)蛋白分別出現(xiàn)在200 kDa和44 kDa。結(jié)果表明，3種貝類(lèi)分離蛋白富含MHC、MLC和肌動(dòng)蛋白。然而，魚(yú)肉和貝類(lèi)肌肉蛋白組成之間存在明顯差異性，貝類(lèi)肌肉含有形成粗絲的核心蛋白副肌球蛋白，并集中在97 kDa[37]。提取過(guò)程中NaOH和HCl溶液的濃度同時(shí)影響提取分離蛋白的形態(tài)，導(dǎo)致肌原纖維蛋白的降解，從而使MHC的含量下降[38]。相關(guān)研究顯示pH調(diào)節(jié)過(guò)程中，酸性或堿性pH條件下，分離蛋白對(duì)內(nèi)源性蛋白酶高度敏感，貝類(lèi)肌肉中富含蛋白酶，因此，圖譜中22 kDa、18 kDa和16 kDa等小分子蛋白條帶可能是蛋白提取過(guò)程中，由于蛋白酶降解所產(chǎn)生[39]。

圖4 三種貝類(lèi)分離蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of the three shellfish protein isolates注：泳道1～3: SPI,CPI,API (β-巰基乙醇還原處理)，泳道4～6: SPI,CPI,API(無(wú)β-巰基乙醇還原處理)，M：蛋白分子量量標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)論

pH調(diào)節(jié)法可有效提取水產(chǎn)動(dòng)物肌肉中的營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)。上述研究結(jié)果表明采用此方法提取的3種貝類(lèi)分離蛋白SPI、CPI和API的粗蛋白含量均高于80%(干基)，熱變性溫度分別在57.0、63.6和61.6 ℃；氨基酸分析結(jié)果表明：3種貝類(lèi)分離蛋白是高質(zhì)量氨基酸的良好來(lái)源，根據(jù)FAO/WHO/UNU建議，3種貝類(lèi)分離蛋白必需氨基酸的含量符合成人和嬰兒的氨基酸需求，研究結(jié)果為貝類(lèi)分離蛋白作為高品質(zhì)營(yíng)養(yǎng)蛋白基料應(yīng)用于保健食品生產(chǎn)工業(yè)中提供理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為進(jìn)一步加工利用貝類(lèi)資源開(kāi)發(fā)貝類(lèi)高附加值新型產(chǎn)品提供有效途徑。