丁華建，段鴻緒，王金晶，李崎，李永仙，鄭飛云，劉春鳳，鈕成拓

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

啤酒酵母作為啤酒釀造的重要原料之一，是影響啤酒品質(zhì)的主要因素，對(duì)啤酒質(zhì)量起決定性的作用[1-2]。在工業(yè)化啤酒釀造過(guò)程中，為降低經(jīng)濟(jì)成本，酵母細(xì)胞會(huì)被多次重復(fù)使用，這種操作過(guò)程被稱為傳代(serial re-pitching)[1, 3]。在傳代過(guò)程中，酵母細(xì)胞在發(fā)酵結(jié)束時(shí)被收集并用于新一代的接種，而酵母細(xì)胞用于連續(xù)發(fā)酵的次數(shù)，叫做“代數(shù)”。啤酒釀造工業(yè)中，活躍的、年輕的和生理穩(wěn)定的酵母細(xì)胞是生產(chǎn)高質(zhì)量啤酒必不可少的，一些啤酒廠也盡量避免出現(xiàn)傳代次數(shù)過(guò)多的問(wèn)題[4]。

啤酒酵母根據(jù)發(fā)酵結(jié)束后酵母細(xì)胞在發(fā)酵液中活動(dòng)的狀態(tài)可分為兩類，分別為上面啤酒酵母和下面啤酒酵母。上面啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)又稱艾爾酵母(ale yeast)，多用于生產(chǎn)艾爾型啤酒，而下面啤酒酵母又稱拉格酵母(lager yeast)，用于發(fā)酵拉格型啤酒。目前世界上大多數(shù)工業(yè)啤酒生產(chǎn)中使用拉格酵母進(jìn)行發(fā)酵，通常所說(shuō)的啤酒酵母也大多指拉格酵母。早期對(duì)lager酵母的研究認(rèn)為其是由不同酵母菌株包括S.cerevisiae,S.bayanus,S.bayanusvar.uvarum雜交而來(lái)[5-6]。 2008年Dunn和Sherlock對(duì)17株lager酵母進(jìn)行基因組分析證明了其雜交本質(zhì)，并指出lager酵母的S.cerevisiae部分的親本很可能是艾爾酵母[7]。而真貝酵母(S.eubayanus)菌株的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步確定了lager酵母是由艾爾酵母S．cerevisiae與S.eubayanus雜交而產(chǎn)生的雜交體[8]。在基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，將拉格酵母分為了2組，分別為第1組Saaz/Carlsberg型酵母(S.carlsbergensis)和第2組Forhberg型酵母(S.pastorianus)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)orhberg型酵母能夠利用麥芽三糖而Saaz型酵母不能利用[9]。雖然拉格酵母與釀酒酵母所表現(xiàn)出來(lái)的親緣性很高，但兩者在物質(zhì)代謝尤其是風(fēng)味物質(zhì)代謝調(diào)控上卻有很大的差別，而且與啤酒風(fēng)味代謝相關(guān)的基因基本上都來(lái)自于其“非釀酒酵母”(non-cerevisiae)部分的親本[10]。真貝酵母低溫耐受性非常好，因此，來(lái)自于真貝酵母的這部分基因賦予了啤酒酵母在低溫條件下良好的發(fā)酵能力。

在啤酒傳代發(fā)酵過(guò)程中，酵母細(xì)胞需要應(yīng)對(duì)環(huán)境中的各種壓力，包括滲透壓力、氧化壓力、乙醇?jí)毫Φ?圖1)，當(dāng)酵母細(xì)胞感受到壓力或者對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)產(chǎn)生一種毒性刺激而無(wú)法抵御時(shí)，細(xì)胞將啟動(dòng)自溶程序[11]。 不同于葡萄酒酵母的自溶會(huì)給葡萄酒帶來(lái)面包、黃油等愉悅的香氣[12-13]，啤酒酵母自溶過(guò)程中大量的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏到發(fā)酵液中，對(duì)啤酒的風(fēng)味和品質(zhì)造成不利的影響[1-2, 14-15]。通過(guò)選育耐壓力脅迫的啤酒酵母能夠一定程度上提高酵母的抗自溶能力[16]，然而并不是非常理想。目前國(guó)內(nèi)外少有針對(duì)啤酒酵母在傳代過(guò)程中的生理變化進(jìn)行研究，因此深入理解酵母在自溶脅迫過(guò)程中的生理變化，不僅有助于了解啤酒酵母?jìng)鞔^(guò)程中的抗自溶脅迫機(jī)制，還可以為選育優(yōu)良啤酒酵母提供指導(dǎo)意義。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中酵母受到的各種壓力變化[17]Fig.1 Various stresses encountered by the yeast during brewing process

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

啤酒酵母Pilsner和5-2均為拉格酵母菌株，主要用于拉格型啤酒的釀造，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。酵母提取物和胰蛋白胨均購(gòu)自北京OXOID公司；2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；BacTiter-GloTMMicrobial Cell Viability Assay試劑盒，購(gòu)于Promega公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(紅色熒光)，購(gòu)于Beyotime公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和溶液

YPD培養(yǎng)基：20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母抽提物，20 g/L葡萄糖。

檸檬酸鹽緩沖液：10.51 g/L檸檬酸，14.71 g/L三水檸檬酸鈉，用1 mol/L檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0。

亞甲基藍(lán)染色液：美藍(lán)0.3 g，95%乙醇30 mL，0.1 g/L KOH 100 mL，使用時(shí)稀釋10倍。

磷酸鹽緩沖液(PBS)：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，1.44 g/L Na2HPO4，0.74 g/L KH2PO4，用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值在7.2～7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母細(xì)胞的傳代發(fā)酵

從保藏的菌株斜面上取1環(huán)菌接入 10 mL YPD試管中，于 28 ℃下活化36 h，按1%的接菌量加入到70 mL的三角瓶中于 25 ℃培養(yǎng)48 h，最后按照酵母細(xì)胞濃度 2×107CFU/mL接入2 L帶發(fā)酵栓的錐形瓶中，進(jìn)行發(fā)酵。拉格型酵母Pilsner和5-2于11 ℃下發(fā)酵6 d。等發(fā)酵結(jié)束后，收取新鮮的酵母泥，按照相同的接種量進(jìn)行傳代發(fā)酵，直至第5代。

1.2.2 酵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

收集每代發(fā)酵結(jié)束后的新鮮酵母細(xì)胞，用5%戊二醛(0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH=7.2)前固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗1%鋨酸(0.1 mol/L 磷酸緩沖液，pH=7.2)后固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗，乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥后將樣品粘貼在樣品臺(tái)上，離子濺射儀鍍膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)[18]，而超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后置于透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.3 細(xì)胞死亡率和活性檢測(cè)

定時(shí)對(duì)自溶液取樣，適當(dāng)稀釋后與等量亞甲基藍(lán)染液混勻，染色5 min后用血球計(jì)數(shù)板鏡檢計(jì)數(shù)。細(xì)胞呈藍(lán)色的為死細(xì)胞，無(wú)色的為活細(xì)胞，記錄細(xì)胞總數(shù)和死細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞活性=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.2.4 抗自溶指數(shù)的檢測(cè)

參考許維娜等[11]研究方案，將2 g主發(fā)酵結(jié)束后的酵母泥加到200 mL檸檬酸鹽緩沖液(模擬自溶液)中，28 ℃靜置培養(yǎng)72 h，每12 h取樣檢測(cè)各指標(biāo)。取1 mL樣品在3 000×g離心5 min，沉淀酵母細(xì)胞用于檢測(cè)死亡率，上清液用于測(cè)定在260 nm和280 nm處的吸光度。根據(jù)2個(gè)吸光值與酵母死亡率的比值判定酵母的抗自溶性能。

1.2.5 基于ATP檢測(cè)細(xì)胞活力

參考BactTiter-GloTMMicrobial Cell Vitality Assay試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行細(xì)胞ATP的檢測(cè)。細(xì)胞懸浮在100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0，0.1%葡萄糖和1 mmol/L EDTA)中，并使細(xì)胞濃度控制在106CFU/mL左右，取100 μL進(jìn)行檢測(cè)。這個(gè)化學(xué)發(fā)光的光信號(hào)在5 min后就可用TECAN Infinite?200 多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，而且發(fā)光信號(hào)跟ATP的含量成正比。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

參考ANNA LEWINSKA實(shí)驗(yàn)方法[19]，將細(xì)胞懸浮在pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中，并使細(xì)胞濃度控制在107CFU/mL左右。取1 mL樣品，加入 5 μL DCFH-DA于37 ℃避光反應(yīng)30 min，然后用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(測(cè)試條件：λex=488 nm和λem=525 nm)。

1.2.7 DNA的相對(duì)損傷分析

利用TdT介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色來(lái)檢測(cè)DNA 的損傷[20-21]。具體的操作是參考細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(紅色熒光)說(shuō)明書(shū)，用4%多聚甲醛固定1 h，溶壁酶在37 ℃處理40 min，最后加TUNEL反應(yīng)混合物在37 ℃黑暗中培養(yǎng)1 h，結(jié)果通過(guò)熒光顯微鏡來(lái)計(jì)數(shù)，至少有200個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確定DNA損傷。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

2.1.1 細(xì)胞表面形態(tài)分析

對(duì)0代、3代及5代的酵母細(xì)胞進(jìn)行微觀形態(tài)觀察，掃描電鏡結(jié)果如圖2所示，放大倍數(shù)為3 000倍。發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞在0代多呈橢圓形，表面圓潤(rùn)飽滿，有明顯的出芽現(xiàn)象和芽痕，但是在經(jīng)過(guò)連續(xù)的傳代發(fā)酵后，酵母細(xì)胞的表面就逐漸出現(xiàn)褶皺變化，甚至由于胞內(nèi)物質(zhì)的流失導(dǎo)致細(xì)胞干癟失形，但是細(xì)胞表面依舊無(wú)明顯破損。這說(shuō)明在連續(xù)傳代發(fā)酵過(guò)程中酵母細(xì)胞壁的破壞是局部的、小規(guī)模的，也反映了細(xì)胞壁在抗壓方面所起到的重要作用。同時(shí)，相對(duì)于菌株5-2，可以清晰地看出菌株P(guān)ilsner在傳代過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)變化較大，受損較嚴(yán)重，同時(shí)細(xì)胞表面也出現(xiàn)了干癟失型，這也說(shuō)明了在傳代發(fā)酵過(guò)程中，菌株5-2抗壓能力優(yōu)于菌株P(guān)ilsner。

圖2 不同代數(shù)啤酒酵母的掃描電鏡(SEM)結(jié)果Fig.2 SEM analysis of lager yeasts from different generationsa.b.c分別為Pilsner菌株的0、3、5代的SEM結(jié)果；d.e.f 分別為5-2菌株的0、3、5代的SEM結(jié)果，放大倍數(shù)3 000倍

2.1.2 細(xì)胞壁厚度分析

通過(guò)酵母細(xì)胞的切片透射電鏡圖可以清晰地觀察酵母細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)，也可以清楚的觀察到酵母細(xì)胞壁的狀況，利用標(biāo)尺可以測(cè)定不同代數(shù)的酵母細(xì)胞壁厚度。圖3為Pilsner和5-2菌株0、3、5代細(xì)胞的切片透射電鏡圖，放大倍數(shù)為 15 000 倍。每株菌選取 50個(gè)未發(fā)生芽殖的細(xì)胞，測(cè)定不同位置細(xì)胞壁厚度，進(jìn)行平均后得到的酵母壁細(xì)胞壁厚度如表1所示。

圖3 不同代數(shù)啤酒酵母的切片投射電鏡(TEM)結(jié)果Fig.3 TEM analysis of lager yeasts from different generationsa.b.c分別為Pilsner菌株的0、3、5代的TEM結(jié)果；d.e.f 分別為5-2菌株的0、3、5代的TEM結(jié)果，放大倍數(shù)15 000倍

表1 不同代數(shù)啤酒酵母的細(xì)胞壁厚度

單位：nm

根據(jù)圖3所示，可以很明顯看到在經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代發(fā)酵后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)會(huì)被逐漸水解，這也解釋了為什么細(xì)胞的表面形態(tài)會(huì)在連續(xù)傳代后出現(xiàn)褶皺變化，甚至干癟失形。相對(duì)于菌株5-2，Pilsner細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)水解程度更大，因此才導(dǎo)致其細(xì)胞形態(tài)變化相對(duì)更大。如表1所示，發(fā)現(xiàn)2個(gè)菌株的細(xì)胞壁厚度都在逐漸下降，只是不同菌株的下降趨勢(shì)不同，其中菌株P(guān)ilsner在經(jīng)過(guò)5代發(fā)酵后，由開(kāi)始的233 nm下降到173 nm，厚度減少了25.8%，菌株5-2由開(kāi)始的212 nm下降到186 nm，厚度只減少了12.3%。酵母細(xì)胞壁是一個(gè)動(dòng)態(tài)的且被調(diào)控地非常有序的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其在保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對(duì)壓力上發(fā)揮著重要作用[22-23]。所以細(xì)胞壁厚度相對(duì)薄的Pilsner菌株在經(jīng)過(guò)多次傳代后，細(xì)胞形態(tài)變化較大，胞內(nèi)受損嚴(yán)重，表現(xiàn)出的抗壓能力較5-2弱。

2.2 酵母模擬自溶分析

收集每一代發(fā)酵結(jié)束的酵母泥進(jìn)行模擬自溶分析，結(jié)果如圖4所示。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖4 不同代數(shù)啤酒酵母模擬自溶液中(A260/A280)/死亡率隨時(shí)間的變化情況Fig.4 Changes of (A260/A280) /mortality rate of lager yeastsfrom different generations in citrate buffer

隨著傳代次數(shù)以及自溶時(shí)間的增加，菌株的抗自溶指數(shù)均發(fā)生逐漸下降的趨勢(shì)，不同菌株下降趨勢(shì)不同。在模擬自溶條件下，Pilsner和5-2的抗自溶指數(shù)分別由0代的83和97，下降到3代的40和62，分別下降了51.8%和36.1%，到第5代時(shí)，Pilsner和5-2的抗自溶指數(shù)已經(jīng)達(dá)到21和42，下降了47.5%和32.3%，Pilsner菌株的抗自溶指數(shù)下降趨勢(shì)遠(yuǎn)大于5-2菌株。另外，隨著自溶時(shí)間的延長(zhǎng)，不同代數(shù)的菌株細(xì)胞也是隨著其代數(shù)的增加，抗自溶指數(shù)下降趨勢(shì)變化越加緩慢。由于菌株在傳代過(guò)程中會(huì)逐漸衰老，越加難以抵抗一些惡劣的環(huán)境影響，因此可能導(dǎo)致其細(xì)胞的自溶[14, 24]?？棺匀苤笖?shù)的下降意味著抗自溶能力的下降，從圖中可以很明顯地發(fā)現(xiàn)5-2菌株的抗自溶能力強(qiáng)于Pilsner菌株，所以5-2相對(duì)來(lái)說(shuō)能更好地抵御環(huán)境的影響。

2.3 傳代發(fā)酵及自溶過(guò)程中細(xì)胞活性及活力研究

2.3.1 細(xì)胞活性及活力分析

2.3.1.1 細(xì)胞活性分析

檢測(cè)分析2個(gè)菌株在傳代以及自溶過(guò)程中的細(xì)胞活性，結(jié)果如圖5所示，Pilsner和5-2的細(xì)胞活性在傳代發(fā)酵過(guò)程中緩慢下降，經(jīng)過(guò)5代發(fā)酵后細(xì)胞活性從98.9%下降到95.8%和96%，分別下降了3.1%和2.9%。然而，在自溶過(guò)程中細(xì)胞活性則下降迅速，下降幅度分別達(dá)到37.9%和65.9%。在饑餓狀態(tài)下細(xì)胞活性的下降主要是靠細(xì)胞自身的抗逆性來(lái)維持，所以通過(guò)分析上述數(shù)據(jù)可以明顯地發(fā)現(xiàn)，5-2菌株細(xì)胞抗逆性強(qiáng)于Pilsner。另外，結(jié)合細(xì)胞抗自溶研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性高的菌株，其抗自溶能力也較強(qiáng)。因此在啤酒發(fā)酵過(guò)程中測(cè)定酵母細(xì)胞的活性對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義[25]。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖5 傳代發(fā)酵及自溶過(guò)程中啤酒酵母細(xì)胞活性變化情況Fig.5 Changes of cell viability of lager yeasts from differentgenerations in the process of fermentation and autolysis

2.3.1.2 基于ATP含量的細(xì)胞活力分析

細(xì)胞活力與細(xì)胞內(nèi)ATP含量密切相關(guān)[26]，因此了解ATP含量變化對(duì)細(xì)胞活力有著重要作用。通過(guò)熒光素-熒光素酶反應(yīng)檢測(cè)ATP，其發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ATP含量成比例，由于它的靈敏度和執(zhí)行速度，使其成為一個(gè)應(yīng)用廣泛的檢測(cè)細(xì)胞活力的方法，ATP檢測(cè)結(jié)果用相對(duì)光單位(RLU)來(lái)表示。如圖6所示，ATP含量在傳代過(guò)程以及自溶條件下都出現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)。在傳代過(guò)程中，Pilsner和5-2的胞內(nèi)ATP含量由開(kāi)始的5 400 RLU和7 600 RLU到3代時(shí)下降為2 000 RLU和3 300 RLU，分別下降了63.0%和56.6%，到了第5代，其ATP含量已經(jīng)下降到1 200 RLU和2 300 RLU，與第3代相比又下降了40.0%和30.3%。顯然Pilsner的胞內(nèi)ATP含量下降趨勢(shì)遠(yuǎn)大于5-2，而且初始的ATP水平又遠(yuǎn)低于菌株5-2，說(shuō)明其細(xì)胞活力弱于5-2。此外，在自溶條件下，發(fā)現(xiàn)2株菌株的ATP含量下降趨勢(shì)都是在0～24 h內(nèi)迅速下滑，24 h后下降趨勢(shì)有所緩和，這跟細(xì)胞的抗自溶指標(biāo)變化趨勢(shì)類似，說(shuō)明細(xì)胞活力與細(xì)胞抗自溶能力也有一定的相關(guān)性。另外，從細(xì)胞活性來(lái)看，Pilsner和5-2在傳代的過(guò)程中，從0代到5代其菌株的細(xì)胞活性下降不足5%，但是這2個(gè)菌株的胞內(nèi)ATP水平卻急劇下降到約70%。這表明細(xì)胞活性不足以評(píng)價(jià)啤酒酵母在釀造過(guò)程中的生理能力，所以就需要結(jié)合兩者來(lái)評(píng)估細(xì)胞的生理狀態(tài)，來(lái)反映細(xì)胞的活力。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖6 傳代發(fā)酵及自溶過(guò)程中啤酒酵母細(xì)胞ATP含量變化情況Fig.6 Changes of ATP levels of lager yeasts from differentgenerations in the process of fermentation and autolysis

2.3.2 胞內(nèi)ROS積累評(píng)價(jià)

ROS的檢測(cè)結(jié)果用相對(duì)熒光單位(relative fluorescent unit, RFU)表示，所以確保相同細(xì)胞數(shù)量很關(guān)鍵。對(duì)2株菌株傳代以及自溶過(guò)程中胞內(nèi)ROS積累進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖7 傳代發(fā)酵及自溶過(guò)程中啤酒酵母細(xì)胞內(nèi)ROS變化情況Fig.7 Changes of ROS levels of lager yeasts from differentgenerations in the process of fermentation and autolysis

發(fā)現(xiàn)2株菌株胞內(nèi)ROS的含量在傳代過(guò)程中都出現(xiàn)逐漸積累現(xiàn)象。從0代發(fā)酵結(jié)束至5代發(fā)酵結(jié)束，Pilsner和5-2的胞內(nèi)ROS含量分別從520 RFU和320 RFU，積累到1 400 RFU和740 RFU，分別上升了169%和131%。高活力活性的菌株，其產(chǎn)生的ROS含量相對(duì)少，且穩(wěn)定。而本文的結(jié)果跟前人的研究結(jié)果[27]類似，都出現(xiàn)ROS積累現(xiàn)象。近年來(lái)研究表明，酵母細(xì)胞的復(fù)制老化伴隨著活性氧在母細(xì)胞中的積累。此外，也有研究表明，線粒體已被確定為ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源[28-29]。所以線粒體ROS的增加進(jìn)一步導(dǎo)致了整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的ROS的積累。然而，在自溶條件下，菌株都出現(xiàn)了先下降后上升的波動(dòng)。有研究表明，為了防止細(xì)胞氧化損傷，酵母細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，包括酶和非酶防御機(jī)制來(lái)消除ROS[30]。這就很好的證明了為什么在自溶條件下，ROS會(huì)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。而在惡劣條件下，細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象，這導(dǎo)致了ROS生成和消除之間的不平衡，最終積累了更多的ROS。另外，Pilsner菌株產(chǎn)生的ROS遠(yuǎn)高于菌株5-2，而過(guò)多的ROS則會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的生理功能，所以這也間接表明，5-2細(xì)胞活力比Pilsner更強(qiáng)。

2.3.3 細(xì)胞DNA損傷評(píng)價(jià)

DNA斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)的催化下加熒光探針標(biāo)記的dUTP，從而可以通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP nick-end labeling)法在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA損傷的方法原理[31]。TUNEL法已被廣泛用來(lái)評(píng)估酵母在復(fù)制衰老和時(shí)序衰老過(guò)程中DNA的損傷[27, 32]。在連續(xù)傳代的過(guò)程中和自溶條件下的DNA損傷情況，結(jié)果如圖8所示。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖8 傳代發(fā)酵及自溶過(guò)程中啤酒酵母細(xì)胞DNA損傷變化情況Fig.8 Changes of DNA damage of lager yeasts fromdifferent generations in the process of fermentationand autolysis

細(xì)胞的DNA損傷情況在傳代和自溶過(guò)程中都越來(lái)越嚴(yán)重，而且很明顯的看到，Pilsner菌株的DNA損傷率在第2代就出現(xiàn)迅速上升，整體都高于5-2，而且DNA的損傷趨勢(shì)與ATP下降趨勢(shì)表現(xiàn)幾乎一致，說(shuō)明酵母細(xì)胞ATP變化與DNA損傷有直接關(guān)系。另外，在前面的研究中，發(fā)現(xiàn)酵母在發(fā)酵過(guò)程中，尤其是自溶過(guò)程中，會(huì)伴隨著ROS大量積累，而ROS的積累又進(jìn)一步增加DNA的損傷，因此造成DNA的迅速損傷，如圖9所示。

a.b.c分別為菌株P(guān)ilsner的0、3、5代的DNA損傷熒光結(jié)果，d.e.f 分別為菌株5-2的0、3、5代的DNA損傷熒光結(jié)果，其中紅色細(xì)胞表示DNA受損傷的細(xì)胞圖9 不同代數(shù)啤酒酵母細(xì)胞DNA損傷熒光圖Fig.9 DNA damage fluorescence of lager yeasts fromdifferent generations

3 結(jié)論

在工業(yè)化啤酒釀造過(guò)程中，為降低經(jīng)濟(jì)成本，酵母細(xì)胞會(huì)被多次傳代重復(fù)使用，然而在傳代過(guò)程中，啤酒酵母需要重復(fù)應(yīng)對(duì)環(huán)境中的氧化壓力、滲透壓力等各種壓力，這些壓力會(huì)引起酵母質(zhì)量的下降。當(dāng)酵母細(xì)胞無(wú)法抵御所受壓力時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始自我降解，從而引起酵母的自溶衰亡，而酵母自溶又會(huì)給啤酒的風(fēng)味、品質(zhì)帶來(lái)極其不利的影響。

本研究從生理學(xué)角度深度分析了啤酒酵母在傳代過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)、自溶性能、細(xì)胞活性活力等指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)在傳代培養(yǎng)過(guò)程中，原本表面圓潤(rùn)飽滿的酵母細(xì)胞會(huì)在活力下降后出現(xiàn)褶皺，甚至因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重水解而干癟失型。同時(shí)，細(xì)胞壁厚度在傳代過(guò)程中也會(huì)逐漸變??；(2)在模擬自溶液中，菌株的抗自溶能力隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸減弱，其中菌株P(guān)ilsner自溶程度和死亡率明顯高于5-2；(3)在傳代發(fā)酵及自溶過(guò)程中，2個(gè)菌株的細(xì)胞活性均呈緩慢下降趨勢(shì)，而兩者的細(xì)胞活力則呈現(xiàn)迅速下降趨勢(shì)。在細(xì)胞活性下降5%時(shí)，Pilsner和5-2的胞內(nèi)的ATP水平已經(jīng)急劇下降達(dá)到70%，因此需要結(jié)合兩者來(lái)評(píng)估細(xì)胞的生理狀態(tài)，來(lái)反映細(xì)胞的活力；(4)高活力的菌株其所表現(xiàn)的抗自溶能力、抗壓能力都很強(qiáng)，而且高活力的菌株所產(chǎn)生的ROS含量相對(duì)少，且穩(wěn)定，基本維持在300～1 000 RFU，DNA損傷速度也會(huì)相對(duì)緩慢。另外，胞內(nèi)ROS的積累也會(huì)增加DNA的損傷。研究啤酒酵母在傳代及自溶過(guò)程中的生理性能變化，不僅對(duì)現(xiàn)有生產(chǎn)菌株的優(yōu)劣和傳代能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)選育優(yōu)良啤酒酵母也具有重要指導(dǎo)意義。