戈勝?gòu)?qiáng)，張瀟月，呂 艷，王振忠，韓乃君，張永強(qiáng)，錢鶯娟，蔡玉梅，吳曉東，王志亮

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271001；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部動(dòng)物健康與食品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095）

自1921年報(bào)道以后，在很長(zhǎng)一段時(shí)間里非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）一直在非洲流行，并沒有引起大多數(shù)國(guó)家，特別是主要豬肉生產(chǎn)國(guó)的重視，直到1957年ASFV傳入葡萄牙、1960年傳入西班牙后才引起國(guó)際廣泛關(guān)注。1957年，葡萄牙因ASFV傳入導(dǎo)致?lián)p失17 000頭豬后才開始研究ASFV，發(fā)現(xiàn)ASFV感染的紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象和ASFV可以在細(xì)胞上繁殖傳代[1-3]。早期研究就已發(fā)現(xiàn)，分離強(qiáng)毒株在細(xì)胞上連續(xù)傳代后再次接種豬不再出現(xiàn)典型的臨床癥狀，而且這些豬可以經(jīng)受住同源強(qiáng)毒株的攻擊[3]。但后期的一些研究卻發(fā)現(xiàn)，某些毒株在傳代細(xì)胞系連續(xù)傳代后雖然毒力減弱，卻不能提供同源保護(hù)[4]。同時(shí)，不同ASFV在不同細(xì)胞上的適應(yīng)性傳代結(jié)果并不相同。面對(duì)上述進(jìn)展，國(guó)內(nèi)尚無專業(yè)材料進(jìn)行論述，因此本文將對(duì)國(guó)際上ASFV細(xì)胞傳代致弱毒株相關(guān)研究進(jìn)行整理，分析其傳代致弱規(guī)律，從而為我國(guó)ASFV細(xì)胞適應(yīng)株研究及新型疫苗研制提供參考。

1 細(xì)胞傳代致弱株研究歷程

自1957年ASFV傳入葡萄牙后，就在西歐逐步擴(kuò)散蔓延并傳至南美洲。因流行毒株只有基因I型，早期研究主要使用基因I型毒株進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)研究，代表適應(yīng)株如L'60BM89、BA71v、E75CV1等。ASFV細(xì)胞適應(yīng)株研究最早開始于20世紀(jì)60年代，首先研究的母本毒株主要有Lisbon 60毒株（1960年分離自葡萄牙里斯本發(fā)病家豬）、葡萄牙分離株1455（1961年分離自葡萄牙）和Hinde毒株（分離自肯尼亞）。1961年，Ribeiro等將Lisbon 60毒株在骨髓細(xì)胞傳代89代后（L'60BM89[3]），又在Vero細(xì)胞上繼續(xù)傳代15代[5]，證明ASFV可在傳代細(xì)胞系繁殖。1963年，Ribeiro等[6]又將葡萄牙1455毒株在骨髓細(xì)胞上連續(xù)傳代并發(fā)現(xiàn)其毒力逐漸致弱。葡萄牙1455毒株傳代至40代后接種動(dòng)物仍可導(dǎo)致典型的臨床癥狀，當(dāng)傳代至70代時(shí)，臨床癥狀大大減輕并能抵御強(qiáng)毒株攻擊[7]。

1962年，Malmquist等將Hinde毒株（分離自肯尼亞）在豬腎細(xì)胞（PK-2a）上傳代，當(dāng)傳至75代或更高代次后（90、103和104代），發(fā)現(xiàn)傳代毒株接種豬完全存活[2]；使用90代毒株免疫豬后再使用親本強(qiáng)毒株接種（105TCID50），發(fā)現(xiàn)接種豬均死亡，但先使用103代毒株免疫再使用50代毒株免疫的接種豬能抵御親本強(qiáng)毒株攻擊[8]，證明細(xì)胞傳代致弱毒株可以產(chǎn)生部分保護(hù)力。1963年Botija[9]將5株西班牙分離株在PK-2a細(xì)胞和白細(xì)胞上連續(xù)傳代，也發(fā)現(xiàn)毒力減弱，其中一株毒株在傳至60代以后對(duì)豬無任何致病力。1965年Hess等也利用PK-2a細(xì)胞傳代致弱多株ASFV[10]，1974年利用幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（baby hamster kidney cells，BHK21）傳代致弱Tengani毒株[11]。

1967年，Bannister等[12]使用葡萄牙疫苗候選株進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。該毒株以Lisbon 60毒株為母本，在豬骨髓細(xì)胞上繼續(xù)傳至81代所得。疫苗株接種1頭豬后（114號(hào)），將第3天體溫反應(yīng)最大時(shí)采集的肝素抗凝血肌肉注射另外4頭健康豬（115、116、117和118號(hào)），結(jié)果未出現(xiàn)體溫升高和臨床反應(yīng)。接種后第71天，4頭豬飼喂含有葡萄牙強(qiáng)毒株的血液和組織，進(jìn)行口腔感染試驗(yàn)（第1次攻毒），4頭豬均未出現(xiàn)體溫升高和臨床反應(yīng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證疫苗效果，對(duì)其中的2頭豬（115和117號(hào)）在第87天時(shí)（飼喂強(qiáng)毒后第16天），進(jìn)行第二次攻毒試驗(yàn)（肌肉注射3 mL強(qiáng)毒血液），結(jié)果115和117號(hào)豬初期均未出現(xiàn)體溫升高和臨床反應(yīng)，但115號(hào)豬在第108天后（第2次攻毒后第22天）開始出現(xiàn)4輪溫度上下波動(dòng)隨后逐漸升溫，直至按計(jì)劃撲殺時(shí)達(dá)到最高溫度（41.3 ℃）。同年，Greig等[13]對(duì)Spencer株（1951年分離自南非約翰內(nèi)斯堡）、Portuguese challenge株（分離自葡萄牙）、Gasson株（1950年分離自肯尼亞）進(jìn)行細(xì)胞連續(xù)傳代并使用親本毒株攻毒驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Spencer株傳至35代后，接種豬無臨床癥狀且能保護(hù)接種豬免受親本毒株攻擊；Portuguese challenge株傳至34代后，接種豬出現(xiàn)體溫小幅波動(dòng)且能為接種豬提供針對(duì)親本毒株的保護(hù)；Gasson株傳至23代后，接種豬毒力減弱但不能保護(hù)接種豬免受親本毒株攻擊（接種2頭豬，其中1頭死亡，1頭升溫后恢復(fù)正常但未能抵抗親本毒株攻擊）。

1968年，Stone等[14]利用致弱的Lisbon 60毒株肌肉注射免疫22頭豬（接種劑量每頭105TCID50/mL）并于免疫后第117天進(jìn)行同源毒株攻毒試驗(yàn)（使用Lisbon 60攻毒發(fā)病豬脾臟勻漿液，稀釋至104LD50）。所有免疫豬健康存活，但隨后攻毒的18頭豬中有17頭豬出現(xiàn)體溫反應(yīng)，其中4頭死亡；攻毒后第23天撲殺存活的14只豬，制備肺臟和脾臟混合勻漿液并繼續(xù)接種2頭健康非免疫豬，結(jié)果2頭豬均死亡。同年，Coggins等將肯尼亞強(qiáng)毒株（Hinde WH II virus）[15]和烏干達(dá)強(qiáng)毒株（Uganda ASF virus）[16]在細(xì)胞上連續(xù)稀釋傳代，發(fā)現(xiàn)部分毒株的紅細(xì)胞吸附功能丟失，但繼續(xù)更換到豬體內(nèi)傳代，可能會(huì)重新獲得紅細(xì)胞吸附功能。無紅細(xì)胞吸附功能的毒株毒力減弱，接種豬后大部分豬存活并能抵御強(qiáng)毒株攻擊。

從1976年開始，有研究人員將BA71株（1971年分離自西班牙巴達(dá)霍斯省一發(fā)病豬脾臟，已在豬骨髓細(xì)胞傳代36代）在Vero細(xì)胞上適應(yīng)傳代100代，最終獲得無致病力的Vero細(xì)胞適應(yīng)株（BA71v）[17-19]。1979年，Thomson等[20]使用致弱的CV毒株（1962年分離自南非，在細(xì)胞上連續(xù)傳44代致弱）接種2頭豬，發(fā)現(xiàn)使用強(qiáng)毒株攻毒后不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)力。俄羅斯國(guó)家獸醫(yī)病毒學(xué)和微生物學(xué)研究所（National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology，VNIIVViM）也制備了多株細(xì)胞傳代致弱株，如剛果KK-262株（將剛果1949年分離株在豬腎細(xì)胞傳至 50代后再在豬骨髓細(xì)胞傳262代）和法國(guó)FK-32/135株（將法國(guó)1964年分離株在豬骨髓細(xì)胞上傳135代）[21-22]等。但上述毒株未進(jìn)行免疫接種及攻毒保護(hù)試驗(yàn)。

1981年，Ruiz-Gonzalvo等[23]將E75強(qiáng)毒株（1975年分離自西班牙）在猴腎成纖維細(xì)胞（CV1）上連續(xù)傳4代，獲得E75CV1毒株（也稱258-CV1-4），將其接種25頭家豬后發(fā)現(xiàn)有20頭豬存活，且能部分抵御同源強(qiáng)毒株的攻擊。后期研究使用類似策略對(duì)E70強(qiáng)毒株（1970年分離自西班牙）進(jìn)行了更多代次傳代，如MS14和MS44（在猴腎細(xì)胞分別傳14代[24]和44代[24-25]），但其主要目的是將該毒株用于基因組比對(duì)分析[26]或作為代表毒株進(jìn)行毒力基因研究。2015年對(duì)E75CV1進(jìn)行更深入研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該毒株以105和102HAU50劑量肌肉注射接種家豬出現(xiàn)部分死亡，以104HAU50接種卻能全部存活且能抵御同源毒株攻擊[27]。

2007年ASFV傳入格魯吉亞并相繼傳入俄羅斯、羅馬尼亞、德國(guó)等東歐、中歐國(guó)家后，該病毒研究方向開始向基因II型毒株傾斜。2015年，Krug等[4]將格魯吉亞毒株（ASFV-G）Vero細(xì)胞適應(yīng)株第30代、60代、80代和110代傳代毒株進(jìn)行全基因序列分析和攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vero細(xì)胞適應(yīng)株全基因組序列在左臂和右臂特定位置發(fā)生了漸進(jìn)性丟失，各代次毒株以104HAD50劑量接種易感豬后，第110代毒已無任何臨床反應(yīng)，但攻毒后無法提供有效保護(hù)。

2015年Balysheva等[28]將Stavropol 01/08強(qiáng)毒株在豬腎胚胎細(xì)胞系與豬淋巴細(xì)胞混合細(xì)胞系上（the hybrid cell line SPEV TK with pig lymphocytes，A4C2）傳14代、24代和33代，在CV細(xì)胞和豬腎細(xì)胞（PSGK-60）上分別傳20代，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A4C2/9k細(xì)胞的14代毒和PSGK-60細(xì)胞的20代毒均表現(xiàn)強(qiáng)毒特性，接種豬全部死亡。A4C2/9k細(xì)胞的24代、33代毒和CV細(xì)胞的20代毒毒力減弱，接毒豬全部存活，但無法保護(hù)豬免于強(qiáng)毒株攻擊。

2020年，俄羅斯聯(lián)邦病毒學(xué)和微生物學(xué)研究中心（原全俄獸醫(yī)病毒學(xué)與微生物學(xué)研究所）Alexey等[29]將其實(shí)驗(yàn)室研制的弱毒株按照血清群分類進(jìn)行了詳細(xì)比對(duì)分析。這些弱毒株絕大多數(shù)通過細(xì)胞傳代致弱（主要是豬骨髓細(xì)胞），如血清I型的LK-111株、Katanga-350株，血清II型的KK-202株，血清III型的MK-200株，血清IV型的FK-32/135株，血清V型的TSP-80/300株，血清VI型的TS-7/230株，血清VII型的UK-50株和血清VIII型的RK-30株。這些毒株均已致弱并可對(duì)強(qiáng)毒株攻擊提供不同水平的免疫保護(hù)。

ASFV細(xì)胞傳代致弱株是疫苗研究歷史中的重要組成部分，也是未來有望推向市場(chǎng)的候選方向之一。如歐盟正在主導(dǎo)實(shí)施疫苗研制計(jì)劃（Vacdiva project），將俄羅斯研制的傳代細(xì)胞適應(yīng)弱毒株（Arriah CV-1株）作為未來重點(diǎn)研究的3個(gè)疫苗候選株之一[30]。此外，經(jīng)過大量比對(duì)試驗(yàn)驗(yàn)證，俄羅斯聯(lián)邦病毒學(xué)和微生物學(xué)研究中心挑選出的FK-32/135株也具有較好的研究潛質(zhì)，但仍需對(duì)其接種途徑進(jìn)一步研究探索（模擬自然感染途徑）[29]。

2 細(xì)胞傳代致弱株研究意義

在ASFV傳播的100年中，很多國(guó)家曾經(jīng)借助嚴(yán)格的生物安全防控措施成功凈化了ASFV。但是ASFV具有致死率高，低溫環(huán)境抵抗力強(qiáng)，可借助冷凍豬肉制品、泔水和軟蜱傳播等特點(diǎn)，使得該病的疫苗使用需求高于其他疫病。2017年，歐盟發(fā)布ASFV疫苗可行性發(fā)展線路圖，仍將研制ASFV疫苗放到了控制和根除ASFV的重要位置[31]。早期ASFV弱毒株研制主要通過細(xì)胞傳代方式致弱，如BA71v，E75CV1等。但增加傳代次數(shù)會(huì)導(dǎo)致ASFV毒力降低，難以提供對(duì)親本毒株的攻毒保護(hù)，因而很難找到合適的傳代次數(shù)進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)，具有一定的盲目性和隨機(jī)性，更無法預(yù)判攻毒保護(hù)效果。因此，相較于減毒疫苗株制備，細(xì)胞傳代致弱株/適應(yīng)株在其他方向，如滴度測(cè)定方法建立[17]、基因組功能研究[26，32]和致病機(jī)理研究[33]等方向發(fā)揮的作用可能更大。特別在全基因組比對(duì)分析研究中，通過細(xì)胞傳代致弱株丟失基因的區(qū)域分析，對(duì)于基因敲除弱毒疫苗研究具有很好的指導(dǎo)借鑒作用。如，格魯吉亞株（ASFV-G）在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳至60代后，其I177L基因編碼氨基酸序列發(fā)生了1個(gè)點(diǎn)突變（第42位由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸）[4]，這可能為后期I177L基因缺失株[34]研制提供了一定線索。同時(shí)，20世紀(jì)60年代在西班牙和葡萄牙大范圍使用弱毒疫苗（在豬骨髓細(xì)胞上連續(xù)傳代所得）導(dǎo)致的“免疫失敗事件”，使得科學(xué)家認(rèn)識(shí)到接種豬本身的免疫機(jī)能狀態(tài)會(huì)影響弱毒苗效果。如，無紅細(xì)胞吸附活性的Kc-160株，以107.5TCID50的劑量接種健康家豬，會(huì)有75%～80%的豬出現(xiàn)輕微或中等臨床反應(yīng)，但接種免疫機(jī)能降低的豬會(huì)發(fā)生20%的死亡[29]。

因ASFV一般不適應(yīng)在傳代細(xì)胞系中繁殖，所以傳統(tǒng)的細(xì)胞傳代致弱株在傳代細(xì)胞系連續(xù)傳代之前都需要進(jìn)行一定的馴化，這也在一定程度上限制了弱毒疫苗株進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。但近期有多篇報(bào)道稱找到了支持ASFV高效復(fù)制的傳代細(xì)胞系，如A4C2/9K[35]、WSL[36]（野豬肺細(xì)胞）、MA104（猴腎細(xì)胞）[37]、ZMAC-4（胎豬肺巨噬細(xì)胞）[38]和IPKM（豬腎巨噬細(xì)胞）[39]等。這些細(xì)胞系都在一定程度上滿足了ASFV連續(xù)傳代的科研目的，但連續(xù)傳代后是否像其他細(xì)胞系一樣發(fā)生基因丟失或免疫原性改變等，仍需大量試驗(yàn)驗(yàn)證和探討。