王亞非，邢姝琴，尉志強(qiáng)，黃江海，劉 潔，胡 岳，李運(yùn)海

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 骨科，北京 100078)

骨肉瘤是較常見的發(fā)生在青少年或兒童的一種惡性骨腫瘤，在小兒骨惡性腫瘤中最多見，約為小兒腫瘤的5%[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的迅猛發(fā)展，經(jīng)手術(shù)聯(lián)合化療后，骨肉瘤患者的5年生存率已提高到約50%～70%，但化療藥物的耐藥性及存在的嚴(yán)重毒副作用使得治療效果難以令人滿意[2]。近年來，在祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中尋找療效顯著且毒副作用小的抗腫瘤藥物是研究熱點(diǎn)之一。巴戟天是我國“四大南藥”之一，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨等功效，研究表明，巴戟天含藥血清能促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，抑制破骨細(xì)胞分化，升高成/破骨細(xì)胞比例，降低骨代謝，保護(hù)骨組織[3]。巴戟天作為治療骨肉瘤中藥復(fù)方中的常見藥物，其單味藥或有效成分對骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制的相關(guān)報(bào)道卻甚少。JNK信號通路是MAPK家族中三條經(jīng)典的凋亡通路之一，在細(xì)胞凋亡尤其是腫瘤細(xì)胞的凋亡過程中扮演了關(guān)鍵角色[4]。本研究以人骨肉瘤MG63細(xì)胞為研究對象，采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst熒光染色、Western-blotting等實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究巴戟天含藥血清對MG63細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，并從JNK通路探討潛在的作用機(jī)制，為闡明巴戟天抗腫瘤活性及其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級4周齡SD大鼠12只，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證為SCXK(京)2016-0006；人骨肉瘤MG63細(xì)胞株(北納創(chuàng)聯(lián))；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco)；兔抗鼠JNK、p-JNK、Bad、p-Bad、Cleaved caspase-3多克隆抗體(英國Abcam)；IgG-HRP標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體(武漢博士德)；MTT粉末、Hoechst 33258染液(上海碧云天)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物)；巴戟天顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(美國Thermo)；倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)；流式細(xì)胞儀(美國BD)；凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad)。

1.2 含藥血清的制備 12只SD大鼠隨機(jī)分為4組，包括空白組和低、中、高劑量巴戟天組，每組3只。低、中、高劑量組分別給予0.54、1.08、2.16 g/kg的巴戟天藥液(相當(dāng)于臨床等效劑量的2、1、0.5倍)，以10 mL/kg灌胃，空白組則給予等體積蒸餾水。每天上、下午固定時(shí)間各給藥1次，連續(xù)灌胃3 d，第4天上午灌胃完成后1 h，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg)，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h，于3 000 rpm條件下離心10 min，分離血清，56 ℃水浴下滅活30 min，分裝、保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤MG63細(xì)胞株所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每隔2～3 d胰酶消化并傳代，定時(shí)更換培養(yǎng)液。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖率 取處于對數(shù)生長期的人骨肉瘤MG63細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL，每孔100 μL分別接種于兩塊96孔板中。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液。設(shè)置低、中、高濃度巴戟天含藥血清組，同時(shí)設(shè)置空白組和對照組，空白組除不加細(xì)胞懸液外其余同藥物組，對照組則加入空白血清，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h后，加入MTT液避光孵育4 h，然后加入DMSO液，室溫下振蕩10 min，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定各孔的吸光度值(A值)，并計(jì)算細(xì)胞增殖率：增殖率/% =(A藥物組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 消化并收集MG63細(xì)胞于離心管中，每組細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL，1 000 rpm條件下離心5 min，去除上層液體，并加入PBS液洗滌兩次，每管加入200 μL的Binding Buffer液懸浮細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC液，混勻，再加入5 μL Propidium Iodide(PI)，混勻，4 ℃避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，采用Cell Quest軟件分析得出各組細(xì)胞的凋亡率。

1.6 Hoechst 33258熒光染色檢測細(xì)胞凋亡形態(tài) 將處于對數(shù)生長期的MG63細(xì)胞以每孔5 000個(gè)接種至96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，對照組與藥物組分別加入空白血清和低、中、高濃度的含藥血清，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出96孔板，棄去培養(yǎng)液，加入PBS液洗滌3次，然后每孔加入Hoechst 33258染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min；孵育完成后，棄去孔內(nèi)染液，PBS洗2次后，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的凋亡形態(tài)。

1.7 Western-blotting法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取藥物干預(yù)完成后的各組細(xì)胞，加入1 mL RIPA液裂解20 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒法測定細(xì)胞總蛋白含量。經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入稀釋后的一抗(目的蛋白按1∶1 000稀釋，內(nèi)參GAPDH按1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。洗滌條帶，加入IgG-HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫下孵育4 h，洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯影。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析條帶灰度值，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白對應(yīng)灰度值的比值計(jì)算蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 巴戟天含藥血清對MG63細(xì)胞增殖率的影響 結(jié)果如表1所示，以對照組細(xì)胞增殖率為100%，經(jīng)不同濃度的巴戟天含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞增殖水平均受到不同程度的抑制。其中，24 h時(shí)中、高濃度組能明顯抑制MG63細(xì)胞的增殖(P<0.01或P<0.05)，而48 h時(shí)各濃度組均能有效抑制MG63細(xì)胞增殖(P<0.01或P<0.05)，但同濃度下不同干預(yù)時(shí)間比較，僅有低濃度時(shí)48 h較24 h有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。由此可見，巴戟天含藥血清抑制MG63細(xì)胞增殖呈濃度依賴性，但并未見明顯的時(shí)間依賴性。

表1巴戟天含藥血清對MG63細(xì)胞增殖率的影響(%)

組別24 h48 h對照100100低濃度90.14±9.19 84.54±11.60*# 中濃度83.17±10.17*80.71±9.93* 高濃度70.28±8.75**67.88±10.30**

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與24 h比較，#P<0.05。

2.2 巴戟天含藥血清對MG63細(xì)胞凋亡率的影響 與對照組比較，中、高濃度的巴戟天含藥血清均能顯著增加MG63細(xì)胞凋亡(P<0.01)，其中，中濃度組平均凋亡率為15.48%，而高濃度組平均凋亡率達(dá)到24.31%。結(jié)果見圖1、表2。

對照組 低濃度組 中濃度組 高濃度組圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組MG63細(xì)胞凋亡率

表2巴戟天含藥血清對MG63細(xì)胞凋亡率的影響(%)

組別凋亡率對照6.74±0.46低濃度10.11±1.33中濃度 15.48±1.19**高濃度 24.31±2.08**

與對照組比較，**P<0.01。

2.3 巴戟天含藥血清對MG63細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響 如圖2所示，對照組MG63細(xì)胞形態(tài)正常，分布較均勻，細(xì)胞熒光呈暗藍(lán)色，無明顯的凋亡特征；低濃度組細(xì)胞形態(tài)、分布及熒光顏色與對照組無明顯差異；而中、高濃度組細(xì)胞數(shù)目減少，分布散亂，部分胞核碎裂，核固縮，細(xì)胞透亮，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，且高濃度組細(xì)胞凋亡形態(tài)更為明顯。

對照組 低濃度組 中濃度組 高濃度組圖2 Hoechst 33258熒光染色檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)(×100)

2.4 巴戟天含藥血清對MG63細(xì)胞JNK通路的影響 與對照組比較，高濃度的巴戟天含藥血清能顯著增加MG63細(xì)胞JNK總蛋白及其磷酸化形式p-JNK蛋白的表達(dá)(P<0.01)，同時(shí)顯著上調(diào)Bad磷酸化蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)，但對Bad總蛋白的表達(dá)無明顯影響；而通過檢測凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的激活態(tài)Cleaved caspase-3發(fā)現(xiàn)，各濃度的巴戟天含藥血清均能有效升高該蛋白的表達(dá)水平(P<0.01或P<0.05)，提示該藥具有良好的促M(fèi)G63細(xì)胞凋亡的效果。結(jié)果見圖3，表3。

圖3 Western-blotting法檢測細(xì)胞JNK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表3巴戟天含藥血清對MG63細(xì)胞JNK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

組別 JNKp-JNKBadp-BadCleaved caspase-3對照 0.68±0.090.23±0.040.57±0.070.22±0.040.19±0.03低濃度0.67±0.140.29±0.040.59±0.060.31±0.030.37±0.05*中濃度0.74±0.090.53±0.07**0.62±0.080.39±0.03*0.42±0.04**高濃度0.81±0.10*0.89±0.13**0.64±0.060.54±0.05**0.82±0.09**

與對照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示，巴戟天含藥血清能有效抑制MG63細(xì)胞增殖，且呈明顯的濃度依賴性，但在中、高濃度時(shí)，48 h干預(yù)結(jié)果對比24 h并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故認(rèn)為不呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，在后續(xù)研究中巴戟天含藥血清干預(yù)時(shí)間依然選擇24 h。

細(xì)胞凋亡在腫瘤治療中一直非常受到重視，腫瘤細(xì)胞的無限生長與其凋亡受到抑制密切相關(guān)，凋亡障礙較大程度地影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。因而，有效拮抗凋亡抑制因子的作用，最大限度地選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而控制腫瘤生長，是腫瘤防治的關(guān)鍵。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 33258熒光染色法定性定量檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)巴戟天含藥血清能明顯誘導(dǎo)MG63細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞核碎裂、固縮、聚集，且呈一定的濃度依賴性，結(jié)果說明巴戟天具有良好的抑制骨肉瘤細(xì)胞生長的作用。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是重要的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，負(fù)責(zé)將各種信號從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞核內(nèi)部，調(diào)控著細(xì)胞新陳代謝、存活、分裂、凋亡等多種重要的生理過程[7]。JNK信號通路是MAPK家族主要成分之一，主要參與細(xì)胞存活、腫瘤形成、生長分化和細(xì)胞凋亡等生理過程[8]。JNK信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也是抗骨肉瘤藥物篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一[9]。Bad是Bcl-2家族中促凋亡的關(guān)鍵成員，其功能主要由磷酸化狀態(tài)的變化來調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)控下游蛋白之間的相互作用和亞細(xì)胞定位[10]。細(xì)胞受到外界刺激后，JNK激活，蘇氨酸183位點(diǎn)磷酸化增加，導(dǎo)致Bad蛋白絲氨酸128位點(diǎn)磷酸化，Bad活化，進(jìn)而在線粒體完整性的基礎(chǔ)上通過激活Caspase家族來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天含藥血清對JNK、Bad總蛋白有一定的調(diào)控作用，但并不明顯，而對其磷酸化形式p-JNK、p-Bad作用顯著，提示巴戟天誘導(dǎo)MG63細(xì)胞凋亡的作用與激活JNK、Bad蛋白有關(guān)。同時(shí)，在檢測Caspase家族中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的激活態(tài)Cleaved caspase-3發(fā)現(xiàn)，各個(gè)濃度的巴戟天含藥血清均能有效增加Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)，其升高水平較p-JNK、p-Bad更為顯著，可能是由于還受到其他凋亡通路的調(diào)控，由此推測JNK通路可能不是巴戟天誘導(dǎo)MG63細(xì)胞凋亡的唯一通路。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天含藥血清能促進(jìn)人骨肉瘤MG63細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與激活JNK信號通路，上調(diào)p-JNK、p-Bad和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究明確了巴戟天含藥血清誘導(dǎo)人骨肉瘤MG63細(xì)胞的作用及部分機(jī)制，為巴戟天抗骨肉癌的臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但其存在更多的潛在作用機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。