王歡,李宏梁，杜磊,尉璐杰

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

納豆是大豆經(jīng)接種納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成的具有特殊氣味的豆制品，除富含多種人體易吸收的營養(yǎng)成分之外，同時還含有多種生理活性物質(zhì)[1]，因此享有“超級健康食品”的美稱。研究證實，經(jīng)常食用納豆可以增強(qiáng)身體機(jī)能，起到良好的保健作用[2]。納豆芽孢桿菌抗逆性極強(qiáng)，具有耐高溫和耐酸的特性，可在微酸環(huán)境中生存長達(dá)4 h[3]，有研究表明，食用納豆之后，納豆菌在腸道內(nèi)萌發(fā)增殖，分泌各種酶及維生素，進(jìn)而促進(jìn)腸道有益菌的增殖，對維持并調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡起著重要作用[4]。大量文獻(xiàn)證明，納豆菌的代謝產(chǎn)物納豆激酶具有多種功能[5-8]，其中，溶栓及抑制血栓形成效果較為突出[9，10]。

目前對納豆的研究開發(fā)主要集中于納豆成分分析，納豆及保健品制作，納豆激酶等功能成分提取，而對于不同產(chǎn)地的納豆菌發(fā)酵性能對比研究報道比較少，因此，本研究擬從北京燕京、日本順食真、大連美屋的鮮納豆產(chǎn)品中分離篩選出多株蛋白酶活性較高的納豆菌，利用其發(fā)酵黃豆，對發(fā)酵特性進(jìn)行對比，以期得到1株蛋白酶活性高且發(fā)酵性能較好的生產(chǎn)用菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

燕京納豆：北京燕京中發(fā)生物技術(shù)有限公司；順食真納豆：北海道小樽市錢函株式會社；御城納豆：大連美屋食品有限公司；枯草芽孢桿菌：實驗室保存；黃豆：山西綠色山區(qū)農(nóng)副產(chǎn)品銷售有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40II型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-C-1 全溫振蕩器 上海中庸檢驗設(shè)備有限公司；BSC-1300II超凈工作臺、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BK5000生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；722N可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 液體種子培養(yǎng)基

蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂1.5%，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 脫脂牛奶培養(yǎng)基

A脫脂奶粉4% 115 ℃滅菌15 min；B 瓊脂粉4%，121 ℃滅菌15 min；冷卻后混勻倒平板。

1.3.3 明膠培養(yǎng)基

蛋白胨0.5%，明膠12%，pH 7.2～7.4，115 ℃滅菌20 min。

1.3.4 甲基紅培養(yǎng)基

蛋白胨0.5%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌30 min。

1.3.5 淀粉水解培養(yǎng)基

A 肉汁胨：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，pH 7.1～7.6；B 肉汁胨中加0.2%的可溶性淀粉，121 ℃滅菌20 min。

1.3.6 LB瓊脂培養(yǎng)基

胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，瓊脂粉1.5%，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種分離

采用平板稀釋法進(jìn)行分離。取3種市售鮮納豆各25 g，分別置于225 mL滅菌生理鹽水中，制得10-1稀釋度的菌懸液，于120 r/min震蕩30 min，80 ℃水浴30 min(目的是殺死雜菌及納豆菌營養(yǎng)體)，然后迅速冷卻至室溫制得芽孢懸液。將芽孢懸液進(jìn)行梯度稀釋，直至稀釋到10-9，取10-7,10-8,10-9稀釋度的樣品勻液100 μL涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基上于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.4.2 菌株篩選

對于從LB瓊脂培養(yǎng)基上分離出的單菌落進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，對符合目標(biāo)的疑似菌株進(jìn)行脫脂牛奶平板篩選。

具體篩選過程如下：用滅菌牙簽蘸取少許待測菌株，點植于脫脂牛奶培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 h，測定透明圈及菌落直徑。

在各產(chǎn)地納豆產(chǎn)品中，分別選取水解圈大的菌落作為后續(xù)實驗菌株，在脫脂牛奶培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離至純，斜面保藏備用。

1.4.3 生理生化鑒定

對篩選出的菌株分別進(jìn)行革蘭氏鏡檢、甲基紅、淀粉水解、明膠液化、檸檬酸鹽利用試驗，試驗參照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行。

甲基紅試驗：有的細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基pH下降至4.5以下，加入甲基紅試劑則呈紅色。

淀粉水解試驗：有的細(xì)菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶，淀粉酶可以使淀粉水解，則淀粉培養(yǎng)基遇碘不再變藍(lán)。

明膠液化試驗：有的細(xì)菌代謝可產(chǎn)生明膠酶，使半固體的明膠培養(yǎng)基失去凝固力而成為流動的液體。

檸檬酸鹽利用試驗：檸檬酸鹽培養(yǎng)基中，檸檬酸鈉為唯一碳源，磷酸二氫銨為唯一氮源，某些細(xì)菌能利用檸檬酸鈉為碳源，分解產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基呈堿性，則加入0.04%酚紅指示液后呈桃紅色。

1.4.4 納豆菌生長曲線的測定

將分離菌株在斜面培養(yǎng)基上活化24 h，用接種環(huán)挑取1環(huán)接種至液體種子培養(yǎng)基(裝液量50 mL/250 mL)中，于37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)，每隔2 h或4 h取樣，按照濃度適當(dāng)稀釋后測定OD600值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制納豆菌的生長曲線，并確定最適種齡。

1.4.4.1 納豆制作過程

取色澤金黃的大豆200 g，按照1∶3(W/V)的比例加入水浸泡過夜，瀝干水分后于高壓滅菌鍋中121 ℃下蒸煮30 min，待溫度降至50 ℃時按照6%的接種量進(jìn)行接種，于37 ℃條件下發(fā)酵24 h后，置于4 ℃冰箱中后熟24 h即可得到納豆成品。

1.4.4.2 納豆發(fā)酵特性評定

對發(fā)酵納豆的感官指標(biāo)、拉絲長度、粘液產(chǎn)率、納豆活菌數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行評價。

在本實驗室選擇16名學(xué)生(8男8女)組成感官評價小組，分別從納豆的顏色、氣味、口感3個方面進(jìn)行打分。隨機(jī)對樣品進(jìn)行數(shù)字編碼，排列樣品順序，滿分10分，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 納豆感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of natto

拉絲長度的測定：將后熟的納豆均勻攪拌后，用鑷子將2顆納豆夾起，向兩側(cè)拉伸，記下絲斷時的長度即為拉絲長度，每個樣品做3次平行試驗，求平均值。

粘液產(chǎn)率的測定：準(zhǔn)確稱取5.000 g的納豆，一式兩份，一份直接在70 ℃烘箱中烘至恒重W1，另一份用蒸餾水洗去納豆表面的粘液，移入烘箱至恒重W2，粘液產(chǎn)率即為(W1-W2)/W1。

納豆活菌數(shù)的測定：采用平板計數(shù)法，參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離結(jié)果

樣品稀釋液經(jīng)80 ℃，30 min高溫處理后，涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h后結(jié)果見圖1。

圖1 納豆菌分離結(jié)果圖Fig.1 The result of natto isolation

由圖1可知，在平皿上總共分離出17株菌，并且多以單菌落分布，說明稀釋度比較合適。17株菌菌落直徑較大，呈圓形，且表面粗糙不透明，污白色或微黃色，中心有少量粘液，均符合納豆菌的菌落形態(tài)。對17株菌編號為A1～A6，B1～B6，C1～C5。

2.2 菌株篩選結(jié)果

主要利用了納豆菌產(chǎn)蛋白酶的特性，將分離得到的17株菌用牙簽點種于脫脂牛奶培養(yǎng)基上，每個平板點4次，37 ℃培養(yǎng)18 h，測定菌落及透明圈直徑，透明圈直徑-菌落直徑表示水解圈大小，其值越大，表示產(chǎn)蛋白酶能力越強(qiáng)。

分離出的17株菌在脫脂牛奶培養(yǎng)基上均產(chǎn)生了透明圈，說明均具有產(chǎn)蛋白酶的能力，其中從產(chǎn)地A中分離的6株菌中，A1產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，從產(chǎn)地B中分離出的6株菌中，B2產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，從產(chǎn)地C中分離出的5株菌中，C2產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，具體結(jié)果見圖2。

圖2 17株菌相對蛋白酶活性Fig.2 Relative protease activities of 17 strains

2.3 生理生化鑒定結(jié)果

對篩選出的3株高產(chǎn)蛋白酶的納豆疑似菌進(jìn)行了6項生理生化試驗，即革蘭氏染色鏡檢、甲基紅、淀粉水解、明膠水解、檸檬酸鹽利用試驗，鑒定過程中以枯草芽孢桿菌做對照，結(jié)果見表2和圖3。

表2 菌株A1，B2，C2生理生化鑒定結(jié)果表Table 2 The physiological and biochemical identification results of strain A1, B2 and C2

圖3 菌株A1，B2，C2生理生化鑒定結(jié)果圖Fig.3 The physiological and biochemical identification results of strain A1, B2 and C2

由表2和圖3可知，篩選出的菌株A1，B2，C2其理化性質(zhì)為：革蘭氏染色、甲基紅試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、耐鹽生長試驗和對照組枯草芽孢桿菌一樣呈陽性結(jié)果，由此判斷這3株菌均為納豆菌。

2.4 發(fā)酵特性對比結(jié)果

2.4.1 3株菌的生長曲線

對納豆菌A1，B2，C2進(jìn)行了生長曲線測定，其結(jié)果見圖4。

圖4 納豆菌A1，B2，C2的生長曲線Fig.4 The growth curves of Bacillus natto A1, B2 and C2

由圖4可知，3株菌在液體種子培養(yǎng)基中的生長狀況大體一致，在0～2 h時，菌體濃度增長緩慢，處于環(huán)境適應(yīng)期；2～14 h時，培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)豐富，菌體大量繁殖，菌體濃度呈指數(shù)上升狀態(tài)；14 h之后，菌體濃度變化不大，納豆菌處于生長穩(wěn)定區(qū)。在衰退期內(nèi)，活菌數(shù)量會有所減少，但從圖4中未能明顯看出衰退期開始時間，這是由于菌懸液的濃度與光密度成正比，利用分光光度計測定菌懸液的光密度來反映菌液濃度時，測定的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包含了活菌與死菌，反映在圖4中則OD600值基本不變。因此，綜合比較，3株菌均選用種齡為14 h的納豆芽孢桿菌進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵試驗。

2.4.2 3種納豆的指標(biāo)評價結(jié)果

2.4.2.1 感官評價對比

對源于不同產(chǎn)地的納豆菌進(jìn)行發(fā)酵試驗，對成品納豆進(jìn)行了感官評定。其中納豆菌A1，C2發(fā)酵的產(chǎn)品均顏色黃亮，具有納豆特有的醬香味，口感軟硬適中，并且粘液較多，A1的感官平均得分為7分，C2的感官平均得分達(dá)8分。納豆菌B2發(fā)酵的產(chǎn)品顏色呈褐色，粘液較少，氨臭味較重，平均感官評分僅為4分。

2.4.2.2 3種納豆的粘液產(chǎn)率、拉絲情況對比

3種納豆的拉絲情況及粘液產(chǎn)率見表3。

表3 3種納豆的拉絲情況及粘液產(chǎn)率Table 3 The wire drawing condition and mucus yields of three types of natto

由表3可知，3種納豆的拉絲長度存在差別：其中C2菌發(fā)酵的納豆拉絲長度最好，為14.8 cm；其次為A1菌發(fā)酵的納豆，拉絲長度為9.83 cm，B2相對較短，拉絲長度僅為6.77 cm。粘液產(chǎn)率印證了拉絲長度，粘液產(chǎn)率值越高，則拉絲情況越好。

2.4.2.3 納豆活菌數(shù)分析

本實驗對接種前的種子液及發(fā)酵好的成品納豆分別進(jìn)行了活菌數(shù)測定。其中納豆菌A1種子液中活菌數(shù)為1.1×109cfu/mL，發(fā)酵的成品納豆中活菌數(shù)為2.21×109cfu/g，活菌數(shù)增長了32.48倍。納豆菌B2種子液中活菌數(shù)為2.4×109cfu/mL，發(fā)酵的成品納豆中活菌數(shù)為4.14×109cfu/g，活菌數(shù)僅增長了27.75倍，納豆菌C2種子液中活菌數(shù)為5.4×108cfu/mL，發(fā)酵的成品納豆中活菌數(shù)為3.78×109cfu/g，活菌數(shù)增長達(dá)115.67倍。盡管這3株納豆菌在液體種子培養(yǎng)液中增殖狀況大致相同，但從以上數(shù)據(jù)來看，當(dāng)以大豆作為培養(yǎng)基質(zhì)時，生長狀況還是存在較大差異。

菌株B2發(fā)酵的納豆中雖然活菌數(shù)最高，但從增長倍數(shù)分析來看，納豆菌B2的增殖能力明顯弱于其他2株菌，納豆菌C2的增殖能力最強(qiáng)，A1次之。而納豆表面的粘液物質(zhì)是納豆菌在生長增殖過程中的代謝產(chǎn)物，這也可能是C2納豆粘液產(chǎn)率及拉絲長度高于其他2株菌發(fā)酵物的原因。

3 結(jié)論

本研究根據(jù)待分離菌株的耐熱性以及水解酪蛋白的特點，從北京燕京、日本順食真、大連美屋納豆中各分離、篩選出1株纖溶活性較高的菌株A1，B2，C2后，以枯草芽孢桿菌為對照，對這3株菌進(jìn)行了生理生化驗證試驗，結(jié)果判定A1，B2，C2均為納豆菌。其中，納豆菌C2在發(fā)酵納豆過程中，活菌數(shù)增殖最快，粘液產(chǎn)率為5.93%，拉絲長度最長且感官評價較高；納豆菌B2在發(fā)酵過程中活菌數(shù)增殖最慢，盡管發(fā)酵的納豆中活菌數(shù)最高，但粘液產(chǎn)率及拉絲長度均不理想，發(fā)酵的產(chǎn)品顏色呈紅褐色，整體評價偏低，納豆菌A1在發(fā)酵過程中，活菌數(shù)增加了32.48倍，粘液產(chǎn)率為4.10%。因此，分離的納豆菌C2有待于進(jìn)一步開發(fā)利用。