趙欣宇，郭宗明*，趙會(huì)，于斌，成華

(1.煙臺(tái)南山學(xué)院 食品系，山東 煙臺(tái) 265713；2.龍口市南山賓館，山東 煙臺(tái) 265700)

隨著食品生物技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的水產(chǎn)品加工方式已經(jīng)越來(lái)越不能滿足人們的需求[1-3]。利用蛋白酶水解生物蛋白，獲得各種氨基酸和功能活性肽，是水產(chǎn)品深加工的一個(gè)重要研究方向[4,5]。蛤蜊作為我國(guó)重要的貝類水產(chǎn)品，具有低脂肪、高蛋白的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)，是研究水解蛋白的良好蛋白質(zhì)來(lái)源[6,7]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花蛤、沙蛤、毛蛤、白蛤：均購(gòu)于龍口市東城區(qū)水產(chǎn)市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)試劑

精制中性蛋白酶(酶活力20萬(wàn)U/g)：產(chǎn)自南寧龐博生物工程有限公司；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(酶活力5萬(wàn)U/g)：產(chǎn)自南寧東恒華道生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑：均為分析純。

1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

DS-1型高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；TG16G型臺(tái)式高速離心機(jī) 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋 天津市華北試驗(yàn)儀器有限公司；JB-2A型磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司；722S型可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；pH SJ-4a型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；BC電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蛤蜊脫殼及勻漿制備方法

為防止加熱使蛤肉蛋白產(chǎn)生熱變性，影響試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)采用物理方法對(duì)蛤蜊進(jìn)行脫殼處理。將蛤蜊洗凈，使用鐵鉗將其外殼剝落，得到完整蛤肉[8，9]。將處理得到的蛤蜊肉，洗凈、瀝水后放入組織勻漿搗碎機(jī)中，充分打漿至均勻，做好標(biāo)記，按品種分類放入4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 水解液制備工藝流程

處理后的蛤蜊勻漿→按物料比1∶3加水→加入蛋白酶水解→90 ℃下滅酶5 min →4500 r/min離心10 min→取上清液即為水解液。

1.4.3 單一酶水解試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.3.1 蛋白酶及蛤蜊種類的確定

試驗(yàn)選擇精制中性蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶在各自適宜的條件下對(duì)4種蛤蜊進(jìn)行水解，以水解結(jié)束后的水解度及4種蛤蜊水解液中氨基酸態(tài)氮含量和鐵含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出水解效果相對(duì)較好的酶及相對(duì)應(yīng)的水解度最高的蛤蜊。

1.4.3.2 單一酶水解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了對(duì)單一酶水解試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，提高水解度，進(jìn)一步對(duì)2種蛋白酶的水解效果進(jìn)行對(duì)比，故而設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)。

根據(jù)單一酶水解試驗(yàn)，分別確定了精制中性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解效果最好的蛤蜊，對(duì)這2組酶和蛤蜊組合進(jìn)行水解工藝優(yōu)化，以水解度為指標(biāo)，分別得出2個(gè)組合的最佳水解工藝條件。選取酶添加量、水解溫度、初始pH值、水解時(shí)間4個(gè)因素作為研究對(duì)象，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)參數(shù)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.4.4 復(fù)合酶水解試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于受到蛋白酶水解作用專一性的限制，一種酶只能對(duì)幾個(gè)特定的酶切位點(diǎn)進(jìn)行水解，水解效果不能達(dá)到理想狀態(tài)。而應(yīng)用復(fù)合酶解技術(shù)，能夠充分發(fā)揮各種酶的互補(bǔ)作用，增強(qiáng)水解效果，使酶解液的水解度更高[10,11]。

1.4.4.1 復(fù)合酶混合比例的確定

精制中性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的水解條件相似，酶切位點(diǎn)又相互補(bǔ)充，可以使2種酶的優(yōu)勢(shì)得到最大程度的發(fā)揮；為了減少水解時(shí)間，將2種酶混合后同時(shí)加入勻漿液。2種蛋白酶使用不同添加比例得到復(fù)合酶，分別對(duì)4種蛤肉勻漿進(jìn)行水解，研究不同對(duì)比例對(duì)水解度變化規(guī)律的影響。

復(fù)合酶解的約束條件為：加酶總量1%，水解溫度50 ℃，初始pH值7，水解時(shí)間4 h。通過(guò)試驗(yàn)探討精制中性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合酶組合比例分別為4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 8個(gè)不同水平，對(duì)蛤肉勻漿酶解液的水解度影響差異；同時(shí)以單一酶正交試驗(yàn)確定的精制中性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶在最佳工藝條件下蛤肉酶解液的水解度作為對(duì)比參照，篩選出2種酶的最佳混合比例。

1.4.4.2 復(fù)合酶水解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在加酶總量為1%的條件下，選取復(fù)合酶比例、水解溫度、初始pH值、水解時(shí)間4個(gè)因素作為研究對(duì)象，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)參數(shù)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定復(fù)合酶解的最佳工藝條件，試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)水平因素表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.4.5 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

蛤肉中總氮含量的測(cè)定：采用微量凱氏定氮法[12,13]。

水解液中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：采用電位滴定法[14]。

水解度的測(cè)定：

水解度=水解液中總氨基酸態(tài)氮的含量原料中的總氮量×100%。

水解液中鐵含量的測(cè)定：鐵是構(gòu)成水產(chǎn)動(dòng)物必不可少的微量礦物質(zhì)，它不僅對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)代謝、營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸、抗體產(chǎn)生、有機(jī)物質(zhì)合成等各種生理活動(dòng)產(chǎn)生影響，還對(duì)生物體內(nèi)酶的活性產(chǎn)生影響[15]。測(cè)定水解液中鐵濃度的變化，能從側(cè)面反映出水解液的水解程度。本試驗(yàn)測(cè)定水解液中鐵含量采用鄰菲羅啉比色法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種蛤蜊中總氮與總鐵的含量

分別對(duì)4種蛤蜊勻漿中的總氮含量和總鐵含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 4種蛤蜊肉的總氮與總鐵含量Table 3 The content of total nitrogen and total iron in four kinds of clam meat

2.2 單一酶水解試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 蛋白酶及蛤蜊種類篩選結(jié)果

按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行水解試驗(yàn)，并測(cè)定4種水解液中氨基酸態(tài)氮含量及鐵含量，測(cè)量結(jié)果見表4。

表4 水解液中氨基酸態(tài)氮含量及鐵含量Table 4 The content of amino acid nitrogen and iron in hydrolysate

同時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，分別計(jì)算出2種蛋白酶水解4種蛤蜊的水解度，并進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見圖1。

圖1 2種蛋白酶水解4種蛤蜊的水解度對(duì)比Fig.1 Comparison of hydrolysis degree of four clams hydrolyzed by two proteases

由表4和圖1可知，在相同水解條件下，精制中性蛋白酶對(duì)毛蛤的水解效果最好，氨基酸態(tài)氮含量為0.94 g/dL，水解度達(dá)39.00%；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對(duì)花蛤的水解效果最好，氨基酸態(tài)氮含量為0.70 g/dL，水解度達(dá)56.91%。

通過(guò)對(duì)比2種酶水解4種蛤蜊的水解度發(fā)現(xiàn)，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶比精制中性蛋白酶的水解效果更好，其中2種酶水解花蛤的水解度差別最大。

2.2.2 單一酶水解條件正交試驗(yàn)結(jié)果

因精制中性蛋白酶對(duì)毛蛤的水解效果最好，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對(duì)花蛤的水解效果最好，故分別對(duì)這2組酶及蛤蜊進(jìn)行正交試驗(yàn)。對(duì)精制中性蛋白酶水解毛蛤的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 精制中性蛋白酶水解毛蛤正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of hydrolyzing Scapharcasubcrenata with purified neutral protease

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，通過(guò)極差對(duì)比可知，影響水解度的各因素依次為：B>C>A>D；由K值確定最佳工藝條件為A2B1C3D1。對(duì)該工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表6。

表6 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The results of verification test

即影響毛蛤水解度的因素排序?yàn)椋核鉁囟?初始pH值>酶添加量>水解時(shí)間，精制中性蛋白酶水解毛蛤肉勻漿的最佳條件組合為：酶添加量1.0%，水解溫度45 ℃，初始pH 7.5，水解時(shí)間3 h，水解度達(dá)42.17%。對(duì)復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解花蛤的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解花蛤正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Orthogonal test results of hydrolyzing short necked clam with compound flavour protease

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，通過(guò)極差對(duì)比可知，影響水解度的各因素依次為：A>C>B>D；由K值確定最佳工藝組合為A1B3C1D2。對(duì)該工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表8。

表8 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果Table 8 The results of verification test

即影響花蛤水解度的因素排序?yàn)椋好柑砑恿?初始pH值>水解溫度>水解時(shí)間，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解花蛤的最佳條件組合為：酶添加量0.8%，水解溫度55 ℃，初始pH 6.5，水解時(shí)間4 h，水解度達(dá)63.05%。

由2種酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果可知，雖經(jīng)過(guò)工藝優(yōu)化，精制中性蛋白酶對(duì)毛蛤的水解度有所提升(由39.00%升至42.17%)，但仍比不上復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對(duì)其的水解度(52.28%)?？傮w來(lái)說(shuō)，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對(duì)蛤蜊的水解效果更好。

2.3 復(fù)合酶水解試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 復(fù)合酶混合比例的確定

將精制中性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶按照一定質(zhì)量比例混合，分別對(duì)4種蛤蜊進(jìn)行復(fù)合酶水解試驗(yàn)，以水解度大小為依據(jù)，確定2種酶的混合比例，試驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 不同比例復(fù)合酶水解試驗(yàn)結(jié)果Table 9 The results of hydrolysis of complex enzyme with different ratios

由表9可知，精制中性蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的混合比例為1∶4時(shí)，4種蛤肉勻漿的水解度最高，分別為：花蛤71.49%、沙蛤63.52%、毛蛤67.78%、白蛤69.65%，均高于精制中性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的單一酶水解的水解度。并且在一定范圍內(nèi)，復(fù)合酶水解度隨著復(fù)合風(fēng)味蛋白酶添加比例的增加而升高；比較4種蛤蜊勻漿的水解度，復(fù)合酶比單一酶的水解效果更好。

2.3.2 復(fù)合酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果

因復(fù)合酶在不同添加比例下均對(duì)花蛤的水解度最高，故以花蛤?yàn)槔?，進(jìn)行復(fù)合酶水解的正交試驗(yàn)。在加酶總量為1%的前提下，分別為2種酶添加比例、水解溫度、初始pH值、水解時(shí)間4個(gè)因素設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)參數(shù)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以水解度為指標(biāo)，得出最佳工藝條件，試驗(yàn)結(jié)果見表10。

表10 復(fù)合酶水解花蛤的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 10 Orthogonal test results of hydrolyzing short necked clam with complex enzyme

利用復(fù)合酶對(duì)花蛤進(jìn)行水解，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)4個(gè)因素的極差對(duì)比可知，影響水解度的各因素依次為：A>B>C>D；由K值確定最佳工藝組合為A3B2C2D3。即影響花蛤水解度的因素排序?yàn)椋?種酶的添加比例>水解溫度>初始pH值>水解時(shí)間，復(fù)合酶水解花蛤的最佳條件組合為：精制中性蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶添加比例為1∶4.5，反應(yīng)溫度50 ℃，初始pH 7.0，水解時(shí)間5 h，水解度可達(dá)73.75%。因此，使用精制中性蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合酶水解蛤蜊時(shí)，使用該工藝條件，可以提高蛤蜊蛋白的水解效果。

3 結(jié)論

由單一酶水解試驗(yàn)結(jié)果可知，精制中性蛋白酶對(duì)毛蛤的水解效果最好，氨基酸態(tài)氮含量為0.94 g/dL，水解度為39.00%；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對(duì)花蛤的水解效果最好，氨基酸態(tài)氮含量為0.70 g/dL，水解度為56.91%；總體來(lái)說(shuō)，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的水解效果比精制中性蛋白酶要好。

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，精制中性蛋白酶水解毛蛤的最佳工藝條件為：酶添加量1%，水解溫度45 ℃，初始pH值7.5，水解時(shí)間3 h，水解度達(dá)42.17%；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解花蛤的最佳工藝條件為：酶添加量0.8%，水解溫度55 ℃，初始pH 6.5，水解時(shí)間4 h，水解度達(dá)60.42%。經(jīng)過(guò)工藝優(yōu)化，精制中性蛋白酶對(duì)毛蛤的水解度有所提升(由39.00%升至42.17%)，但仍比不上復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對(duì)其的水解度(52.28%)。進(jìn)一步確定，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的水解效果要好于精制中性蛋白酶。

由復(fù)合酶解試驗(yàn)結(jié)果可知，精制中性蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的添加比例為1∶4時(shí)，對(duì)4種蛤肉的水解度最高，分別為：花蛤71.49%、沙蛤63.52%、毛蛤67.78%、白蛤69.65%；在一定范圍內(nèi)，復(fù)合酶水解度隨著復(fù)合風(fēng)味蛋白酶添加比例的增加而升高；復(fù)合酶水解蛤蜊的最佳工藝條件為：精制中性蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶添加比例為1∶4.5，水解溫度50 ℃，初始pH 7.0，水解時(shí)間5 h，水解度可達(dá)73.75%。