童星, 彭勃

(1.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528511；2.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；3.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 518064)

酵母菌在醬油發(fā)酵過程中具有重要的意義，是醬油釀造后期風味物質(zhì)的來源[1]，其中魯氏酵母具有較高的耐鹽性，是目前醬油產(chǎn)業(yè)中最常見的產(chǎn)香菌株[2,3]。隨著高鹽稀態(tài)醬油工藝的推行，常常將魯氏酵母等耐鹽產(chǎn)香酵母以人工培養(yǎng)液的形式添加到醬醪中，從而改善醬油釀造中風味的單一性，提高醬油的風味質(zhì)量[4]。因此，酵母添加液中菌株的活力就成為了醬油風味品質(zhì)和生產(chǎn)穩(wěn)定性的重要支撐之一。

目前在醬油的發(fā)酵研究中，人們通常以鏡檢總酵母數(shù)作為評價酵母培養(yǎng)液質(zhì)量的常規(guī)指標，然而日常檢測中發(fā)現(xiàn)當酵母培養(yǎng)液在穩(wěn)定期時該指標波動較少，無法準確預(yù)判酵母添加到醬醪后的酒精發(fā)酵能力。而亞甲基藍染色法、鎂離子釋放法以及平板涂布計數(shù)等檢測方法的操作相對復(fù)雜，檢測周期較長，不利于在生產(chǎn)應(yīng)用中廣泛推廣[5]。酸化力法是檢測酵母活力的一種簡單有效的方法，其原理為酵母細胞在培養(yǎng)液中葡萄糖含量提高時，能夠通過葡萄糖降解促進質(zhì)子泵出細胞外以維持調(diào)整胞內(nèi)的pH穩(wěn)定[6]，從而會引起發(fā)酵液中pH值的變化，這種變化與酵母的活性及其發(fā)酵性能密切相關(guān)[7,8]，是評價酵母活性的有效方法之一[9]。

酸化力法最先被應(yīng)用于啤酒酵母的活力評價[10]，繼而有其適用于工業(yè)酒精酵母的報道[11]，本文通過從天然醬醪中篩選出魯氏酵母作為實驗菌株，研究酸化力法對該菌株活力的檢測效果，并對其影響因素進行穩(wěn)定性探究，最終表明酸化力法能夠高效、可靠地檢測出醬油中魯氏酵母的發(fā)酵活力，在醬油發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)：從天然發(fā)酵醬醪中分離獲得。

酵母培養(yǎng)基：無水葡萄糖5%，酵母提取物1%，磷酸氫二鉀0.5%，醬醪汁10%，氯化鈉10%，pH 5.5，1×105Pa滅菌20 min。

無水葡萄糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀(均為分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；酵母提取物(生化試劑)：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；亞甲基藍(分析純)：上海埃彼化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250型生化培養(yǎng)箱、WBK-6B型電熱恒溫水浴鍋 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BX53型光學顯微鏡 日本Olympus公司；紫外分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；2k15型冷凍高速離心機 Sigma公司；PB-10型pH計、BS323S型電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母泥的制備

實驗室酵母擴培，4000 r/min離心后取沉淀菌體，再用蒸餾水洗滌2次后得酵母泥。

1.3.2 酵母酸化力的檢測[12]

稱取洗滌離心后的酵母若干放到玻璃燒杯內(nèi)，加入50 mL蒸餾水，攪拌，使酵母懸浮，10 min后檢測pH值(pH10)；加入5 mL葡萄糖，再放置攪拌10 min后檢測pH值(pH20)，測定在20 ℃下進行。GIPE值通過下式計算：GIPE= pH20-pH10。

1.3.3 菌體濃度的測定

將菌懸液適當稀釋，用可見分光光度計于600 nm下測定吸收值(OD600)。用相同稀釋倍數(shù)的空白培養(yǎng)基作對照，扣除對照中固形物的吸收值，OD600=OD600讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.3.4 總酵母數(shù)與酵母死亡率的測定

總酵母數(shù)的測定采用血球計數(shù)板法，死亡率的測定采用亞甲基藍染色法[13]。

1.3.5 發(fā)酵實驗

當醬醪pH降至5.2～5.3時添加酵母培養(yǎng)液，添加量1%，分別在添加酵母培養(yǎng)液后第7天和第14天后測定其酒精度。

1.3.6 酒精度測定

酒精度的測定按GB/T 10345-2007《白酒分析方法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸化力法對魯氏酵母活力的評價條件

2.1.1 酵母泥濃度對酸化力測定的影響

圖1 不同酵母泥濃度對酸化力的影響Fig.1 Effects of yeast slurry concentration on acidification power

初定加入葡萄糖的濃度為5%，在室溫下進行檢測，研究不同酵母泥濃度對酸化力的影響。由圖1可知，在酵母泥濃度為0～8%(W/V)時，隨酵母泥濃度增加，GIPE值逐漸增大，其中在0～4%范圍內(nèi)GIPE值有較大的增幅。當酵母泥濃度在8%以上時，GIPE值趨于穩(wěn)定，因此選定8%為酸化力法的酵母泥測量濃度。

2.1.2 葡萄糖濃度對酸化力測定的影響

圖2 不同葡萄糖濃度對酸化力的影響Fig.2 Effects of different glucose concentration on acidification power

由圖2可知，不加入葡萄糖的空白對照，pH不發(fā)生變化，證明不存在底物對實驗結(jié)果的干擾作用。隨著葡萄糖濃度的增加，GIPE值逐漸增大，在0～1%時增加速度最大。當葡萄糖濃度大于5%后，GIPE值緩慢增加，超過10%后GIPE值變化趨于平穩(wěn)。綜合考慮，確定酸化力法的最適葡萄糖濃度為10%。

2.1.3 檢測溫度對酸化力測定的影響

圖3 不同溫度對酸化力的影響Fig.3 Effects of different temperatures on acidification power

由圖3可知，在0～30 ℃范圍內(nèi)，隨測定溫度的升高，GIPE值升高，可見酵母降解葡萄糖的速度在一定范圍內(nèi)與溫度呈正相關(guān)。然而溫度高于30 ℃后，GIPE值開始出現(xiàn)下降趨勢，這與酵母對溫度的耐受性有關(guān)[14]，因此酵母酸化力測試的最佳溫度為30 ℃。

經(jīng)優(yōu)化實驗后，確定酵母泥濃度8%，葡萄糖濃度10%，測定溫度30 ℃為酸化力法測定魯氏酵母活力的最適條件，將該條件應(yīng)用于后續(xù)實驗中。

2.2 酸化力法評價魯氏酵母活力的可行性

2.2.1 不同活性酵母的酸化力評價

酵母的GIPE值依賴于位于質(zhì)膜上的ATP酶質(zhì)子泵活性，通過葡萄糖降解促進質(zhì)子的流出，而死亡細胞的細胞膜及膜的機能遭到破壞，ATP酶也遭到破壞。通過60 ℃水浴保溫2 h后制得死細胞，將不同比例的培養(yǎng)至穩(wěn)定期的酵母活細胞和死細胞進行混合處理，測定其酸化力，見圖4。

圖4 不同活細胞比例酵母的酸化力Fig.4 The acidification power of yeast with different living cell ratios

由圖4可知，死酵母的GIPE值接近0，證明酸化力法測定酵母活力的可行性。隨著活細胞比例的增加，GIPE值增大，且線性關(guān)系良好，說明酸化力法能很好地反映不同活性酵母的酵母活力。

2.2.2 不同老化程度酵母的酸化力評價

酵母在無營養(yǎng)物質(zhì)的環(huán)境下代謝減慢，細胞開始發(fā)生老化，活力降低，隨著時間的延長，老化程度加深，細胞逐步死亡。酵母經(jīng)離心收集、洗滌3次后重懸于無菌去離子水中，在30 ℃分別保溫0，3，6，9，12，24 h，使酵母細胞發(fā)生不同程度的老化，分別測定不同老化程度酵母細胞的酸化力和亞甲基藍染色率，見圖5。

圖5 不同老化程度的酵母酸化力及染色率Fig.5 The acidification power and dyeing rate of yeast with different aging degrees

由圖5可知，隨著酵母老化處理時間的延長，酵母的死亡率增加，GIPE值降低，可以看出GIPE 值與亞甲基藍染色呈反相關(guān)。當進一步饑餓至發(fā)生死亡時(24 h)，GIPE 值降低至0，也就是說酵母完全失去活力。隨著染色率的增加，由GIPE值指示的酵母活力降低，理論與實際相符，表明GIPE值可以較好地反映酵母活力。

2.2.3 酸化力法評價魯氏酵母活力的穩(wěn)定性

表1 酵母GIPE的穩(wěn)定性Table 1 The stability of test of yeast's GIPE

由表1可知，酸化力法的穩(wěn)定性實驗結(jié)果中，GIPE值的相對標準偏差僅為3.39%(n=5)，小于5%，表明該方法評估酵母活力穩(wěn)定、準確、可靠。

2.3 酸化力法評價醬油酵母活力的應(yīng)用

2.3.1 酸化力法評價靜置時間對酵母培養(yǎng)液質(zhì)量的影響

在醬油釀造過程中，有時需要在醬醪中添加酵母菌液來提高醬油的發(fā)酵性能。然而在生產(chǎn)中，由于多種條件的限制會影響操作的及時性，酵母菌液在放置一段時間后會導(dǎo)致其活力的下降，從而影響預(yù)期的效果?？梢酝ㄟ^酸化力法對不同放置時間的魯氏酵母菌液進行活力評估，對菌液的效果進行預(yù)判。

圖6 不同靜置時間的魯氏酵母的酸化力Fig.6 The acidification power of yeast with different static culture time

由圖6可知，在培養(yǎng)基中酵母靜置培養(yǎng)，2 h內(nèi)酵母活力損失少，2 h后酵母活力有一定損失，5 h時酵母活力損失約15.2%。結(jié)果表明：魯氏酵母在培養(yǎng)基中靜置對其活力的影響較大，在生產(chǎn)應(yīng)用中，可以通過酸化力法快速評估酵母菌液的活力，然后根據(jù)評估結(jié)果適當改變菌液的添加量，從而達到預(yù)期的發(fā)酵效果。

2.3.2 酸化力法對醬油發(fā)酵罐中酵母活力的評價

OD600和總酵母數(shù)等指標由于其檢測的快捷，常被作為預(yù)判酵母質(zhì)量的方法，然而這2項指標誤差較大，無法準確評估酵母活力，即當酵母死亡后，這一類指標的檢測結(jié)果仍會處于高值。而使用平板法計算活酵母數(shù)被看作是衡量酵母質(zhì)量高低最準確的方法之一，然而該法卻存在檢驗結(jié)果等待時間過長，人力資源成本花費較高的缺陷。下面使用酸化力法等4種方法對不同醬油發(fā)酵罐中的酵母活力進行評價，對比幾種方法的評價效果。

圖7 不同方法評價醬油發(fā)酵罐中的酵母活力Fig.7 Evaluation of the activity of yeast by different methods

注：1～3號培養(yǎng)罐使用營養(yǎng)強化配方，4～6號培養(yǎng)罐使用正常配方。

由圖7可知，GIPE值的變化趨勢與活酵母數(shù)的變化趨勢最為接近，能較為準確地對酵母的質(zhì)量進行評估。OD600能夠反映不同培養(yǎng)罐間酵母增殖情況的差異，與活酵母數(shù)的變化趨勢在一定程度上吻合，但契合程度低于GIPE值。此外，OD600、GIPE值與活酵母數(shù)的結(jié)果共同表明營養(yǎng)強化配方較正常配方酵母質(zhì)量有所提升。

2.3.3 酸化力法測定醬油中酵母活力與醬醪發(fā)酵性能的對應(yīng)性研究

酵母在發(fā)酵過程中會通過自身生長代謝活動產(chǎn)生一定量的酒精，通過檢測發(fā)酵樣品中的酒精含量變化，能夠在一定程度上反映酵母的發(fā)酵性能。

圖8 酵母活力與產(chǎn)酒精能力的關(guān)系Fig.8 The relationship between the activity of yeast and alcohol production capability

將活細胞和死細胞按不同比例混合接種到醬醪中進行發(fā)酵，在接種前檢測其酸化力，考察其與產(chǎn)酒精能力的相關(guān)性。由圖8可知，GIPE值與添加酵母后7天的酒精度變化趨勢一致，相關(guān)性較好，這與酵母菌的生長特性有關(guān)，高活力的酵母發(fā)酵時生長速度較快，保證有較快的乙醇生成速度和生成量[15]。然而，隨著發(fā)酵時間的延長，在14天時活細胞占比60%以上樣品的酒精度均達2.8%以上。由此可知，醬醪發(fā)酵一段時間后，由于存在通氧、pH、溫度等各種因素的影響，酵母活力低的菌液也可在醬醪中良好增殖，最終達到相似的酒精度，但添加酵母菌液初期的酒精含量變化與GIPE值具有一定的相關(guān)性，因此可以通過酵母添加液的GIPE值控制酵母初期的發(fā)酵情況。

3 結(jié)論

本文通過酸化力法評價從天然醬醪中篩選得到的魯氏酵母活力，經(jīng)測定條件優(yōu)化可知，當魯氏酵母泥濃度8%、葡萄糖添加量10%、檢測溫度30 ℃時評價效果最佳。同時，酸化力法能夠準確地檢測不同活性酵母以及不同老化程度酵母的酸化力，且檢測結(jié)果相對標準偏差僅為3.39%，穩(wěn)定性好。將酸化力法應(yīng)用于醬油發(fā)酵過程中的相關(guān)指標評估發(fā)現(xiàn)，該方法能夠有效評價酵母液靜置過程中的活性變化、醬醪中的酵母活性，以及預(yù)判酵母液添加7天內(nèi)的酒精度變化。應(yīng)用酸化力法評價醬油中的酵母活力操作簡單，結(jié)果準確，穩(wěn)定性好，對醬油發(fā)酵過程中酵母活力的預(yù)判具有重要的指導(dǎo)意義，有一定的應(yīng)用價值。