何祖新,祝磊,黎江華,彭偉,魏大能,吳純潔*
(1.四川得恩德藥業(yè)有限公司,四川 綿陽(yáng) 621100;2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,成都 611137)
花椒系蕓香科花椒屬植物,因其獨(dú)特的“麻辣鮮香”被用來(lái)作為食品調(diào)味料,也被譽(yù)為中國(guó)“八大味”之一,在川渝地區(qū)更是麻辣味川菜、涼菜及火鍋中必不可少的調(diào)味品?;ń分饕t花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)、青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. Et Zucc.)和竹葉椒(ZanthoxylumarmatumDC.)[1],主要的商品有紅花椒、青花椒、藤椒等。花椒既是香料,也是藥用經(jīng)濟(jì)作物。近年來(lái),各地在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、新一輪退耕還林及脫貧攻堅(jiān)等實(shí)施過(guò)程中,將花椒作為主要經(jīng)濟(jì)作物之一,其種植面積與產(chǎn)量得以迅速增加,并形成了以陜西(韓城)、甘肅(武都)、山東(泰安)、四川(漢源、金陽(yáng)、茂汶、三臺(tái)、洪雅等)、重慶(江津)、云南(昭通)等省市為核心區(qū)域的全國(guó)聞名花椒基地[2]。四川作為花椒的重要產(chǎn)區(qū),已出臺(tái)相關(guān)扶持政策,明確到2020年打造成為全國(guó)“花椒產(chǎn)業(yè)第一省”[3]。
目前,四川省栽培的“漢源花椒”、“大紅袍”、“九葉青花椒”、“藤椒”等知名品種均為傳統(tǒng)品種,枝條有較多的刺,采摘用工多,還經(jīng)常刺傷手指,制約了規(guī)?;l(fā)展[4]。日本無(wú)刺花椒的果皮、青果、嫩芽、種子等具有重要的應(yīng)用價(jià)值,并因無(wú)刺或少刺,采摘方便,較國(guó)內(nèi)花椒能節(jié)約大量管理用工,極具生產(chǎn)栽培價(jià)值[5,6]。1994年開(kāi)始,日本金村醫(yī)藥株式會(huì)社有關(guān)專家開(kāi)始在國(guó)內(nèi)深圳、四川、河南、河北分別試栽日本花椒(山椒),但嫁接成活率不高[7]。其后,河北、四川、貴州等省林科院及甘肅隴南市農(nóng)科所等科研院所對(duì)日本無(wú)刺花椒引進(jìn)和培育做了大量研究工作,也培育出部分自己的無(wú)刺品種[8]。日本無(wú)刺花椒的開(kāi)發(fā)利用已成為目前研究的重點(diǎn),但主要集中在其品種選擇、苗木快繁培育、栽培、經(jīng)營(yíng)管理、病蟲(chóng)害防治等方面,而對(duì)于其“香”、“麻”的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)(風(fēng)味特征)的研究較少。因此,本文采用HS-SPME-GC-MS和HPLC技術(shù)分別對(duì)日本無(wú)刺花椒的香味物質(zhì)和麻味物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析,以期為后續(xù)日本無(wú)刺花椒的開(kāi)發(fā)利用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考,并為四川花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。
成熟期日本無(wú)刺花椒:來(lái)源于四川省引種栽培的日本無(wú)刺花椒(朝倉(cāng)山椒),由廣元市昭化區(qū)太公鎮(zhèn)日本無(wú)刺花椒種植基地提供。
羥基-α-山椒素對(duì)照品、羥基-β-山椒素對(duì)照品、羥基-γ-山椒素對(duì)照品:自制,純度均大于98%;甲醇(分析純):成都科龍?jiān)噭S;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純):美國(guó)Sigma-Aldrich公司;水為自制去離子水。
GC-MS-TQ8040氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司;固相微萃取儀、HP-1510頂空萃取器、100 μm PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司;Rxi-624Sil MS毛細(xì)管柱 美國(guó)Restek公司;電子天平 德國(guó)賽多利斯公司;中藥粉碎機(jī) 浙江省永康市溪岸五金藥具廠;超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;超純水器 成都超純科技有限公司。
1.3.1 樣品預(yù)處理
將日本無(wú)刺花椒置于烘箱中,40 ℃低溫干燥,篩去椒目,將干燥果皮粉碎后過(guò)50目篩,備用。
1.3.2 香味物質(zhì)分析[9,10]
1.3.2.1 樣品萃取與脫附
稱取日本無(wú)刺花椒(0.3 g),置于萃取瓶中;230 ℃下活化萃取頭(3 min),將萃取頭插入萃取瓶中,50 ℃下萃取30 min;再將萃取頭插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口,230 ℃下脫附3 min。
1.3.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件
采用HP-5(0.25 mm×30 m,0.25 μm)石英毛細(xì)管柱。升溫程序:起始柱溫50 ℃,保持2 min,以4 ℃/min上升至200 ℃,保持5 min;15 ℃/min上升至240 ℃,保持5 min。載氣為高純度氮(N2),柱前壓53 kPa,分流比36∶1。進(jìn)樣口和接口溫度均為230 ℃;電子轟擊EI離子源,電子能量70 eV;掃描范圍(m/z)50~550,全掃描模式進(jìn)行采集。
1.3.2.3 定性分析
香味物質(zhì)的定性分析由質(zhì)譜儀所帶數(shù)據(jù)包(Wiley Library ver. 9、NIST Library ver. 14和 NIST Library ver. 14s)進(jìn)行自動(dòng)檢索與匹配。本實(shí)驗(yàn)中,僅統(tǒng)計(jì)匹配度大于90的香味物質(zhì),確保數(shù)據(jù)的嚴(yán)謹(jǐn)性。香味物質(zhì)的定量分析則采用峰面積歸一化法。
1.3.3 麻味物質(zhì)分析[11-13]
1.3.3.1 樣品制備
取日本無(wú)刺花椒0.5 g,精密加入甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率240 W,頻率40 kHz)30 min,冷卻至室溫,再次稱定重量,以甲醇來(lái)補(bǔ)足超聲過(guò)程中減失的重量,搖勻,分析前采用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。
1.3.3.2 液相色譜條件
PHENOMENEX C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相:乙腈-水(40∶60),柱溫30 ℃,流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm,進(jìn)樣量10 μL。
1.3.3.3 定量分析
以自制的羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素作為對(duì)照品,配制成系列不同濃度的混合對(duì)照溶液。經(jīng)麻味物質(zhì)定量測(cè)定方法學(xué)考察后,采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。
按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),日本無(wú)刺花椒香味物質(zhì)總離子圖見(jiàn)圖1,GC-MS分析結(jié)果見(jiàn)表1。
圖1 日本無(wú)刺花椒香味物質(zhì)總離子圖Fig.1 Total ion current chromatogram of aroma components of Japanese pepper
表1 日本無(wú)刺花椒香味物質(zhì)的化學(xué)成分Table 1 The chemical composition of aroma components of Japanese pepper
續(xù) 表
由圖1和表1可知,通過(guò)對(duì)日本無(wú)刺花椒的揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析,共鑒定了21個(gè)化合物,占香味化合物總量的99.55%,可反映日本無(wú)刺花椒香味化合物組分的大致情況。主要含有烯烴類化合物13個(gè)、酯類化合物6個(gè)、醛類化合物1個(gè)和醇類化合物1個(gè),分別占香味化合物含量的89.31%,2.83%,5.46%,1.95%。根據(jù)紅花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的GC-MS分析結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[14],紅花椒中主要含有烯類、醇類、酮類、醛類、酯類等揮發(fā)性成分,以檸檬烯含量最高,乙酸芳樟酯含量次之;相比于紅花椒,日本無(wú)刺花椒則以檸檬烯含量最高,小茴香烯含量次之,說(shuō)明小茴香烯可以作為日本無(wú)刺花椒區(qū)別于紅花椒的香味化合物。
2.2.1 色譜行為
在選定的條件下,3個(gè)麻味物質(zhì)的色譜峰均達(dá)到基線分離,分離度與柱效均良好,混合對(duì)照品和樣品的HPLC圖見(jiàn)圖2。
圖2 混合對(duì)照品(A)、樣品(B)的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed standards (A) and sample (B)
2.2.2 線性關(guān)系考察
分別稱取羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素對(duì)照品適量,精密稱定,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,配制成含羥基-α-山椒素0.8 mg/mL、羥基-β-山椒素0.032 mg/mL和羥基-γ-山椒素0.028 mg/mL的對(duì)照品溶液,備用。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液配制成系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣分析3次,并以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸,得到不同對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,各麻味物質(zhì)在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,見(jiàn)表2。
表2 回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations, liner ranges, and correlation coefficients
2.2.3 精密度試驗(yàn)
精密吸取混合對(duì)照品溶液(10 μL),按“1.3.3.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次,測(cè)定峰面積,結(jié)果各成分峰面積的RSD分別是羥基-α-山椒素1.24%,羥基-β-山椒素1.32%,羥基-γ-山椒素1.45%,表明儀器精密度良好。
2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)
精密吸取供試品溶液,按照“1.3.3.2”項(xiàng)下色譜條件,分別于0,4,8,12,18,24 h進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得各成分峰面積RSD分別是羥基-α-山椒素1.01%、羥基-β-山椒素1.35%、羥基-γ-山椒素1.89%,表明提取液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)
精密稱取6份日本無(wú)刺花椒(每份0.5 g),按“1.3.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“1.3.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析,結(jié)果各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為羥基-α-山椒素0.97%,羥基-β-山椒素1.31%,羥基-γ-山椒素1.16%,表明該方法的重復(fù)性良好。
2.2.6 加樣回收率試驗(yàn)
精密稱取6份日本無(wú)刺花椒(每份0.25 g),加入混合對(duì)照品適量,按“1.3.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,計(jì)算各成分的平均回收率。結(jié)果表明,羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ山椒素的平均加樣回收率分別為101.23%,98.52%,97.67%;RSD值分別為1.35%,1.58%,2.05%,表明加樣回收結(jié)果良好。
2.2.7 含有量測(cè)定
精密稱取3份日本無(wú)刺花椒(每份0.5 g),按照上述方法進(jìn)行分析測(cè)定,并計(jì)算各成分含有量。結(jié)果表明,日本無(wú)刺花椒中主要含有羥基-α-山椒素,其含量分別是羥基-γ-山椒素和羥基-β-山椒素含量的21,28倍,見(jiàn)表3。
表3 含有量測(cè)定結(jié)果Table 3 The determination results of content mg/g
本文對(duì)日本無(wú)刺花椒的香味物質(zhì)和麻味物質(zhì)進(jìn)行了定性、定量分析,其中,HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)可準(zhǔn)確分析日本無(wú)刺花椒的香味物質(zhì),有效分離鑒定出21種化合物,主要為烯烴類、酯類、醛類及醇類化合物,并以檸檬烯含量最高,小茴香烯含量次之,2種成分合計(jì)占日本無(wú)刺花椒香味物質(zhì)的66.9%,且小茴香烯也是區(qū)別于紅花椒的香味化合物。本文成功建立了日本無(wú)刺花椒中麻味物質(zhì)的HPLC分析方法,由混合對(duì)照品與樣品的HPLC圖可知,各成分分離效果較理想,適合于麻味物質(zhì)的定量分析;含量測(cè)定結(jié)果表明,日本無(wú)刺花椒主要含有羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及羥基-γ-山椒素,又以羥基-α-山椒素的含量最高,其含量分別是羥基-γ-山椒素和羥基-β-山椒素含量的21,28倍。本研究分析了日本無(wú)刺花椒的香味物質(zhì)和麻味物質(zhì),可為日本無(wú)刺花椒的開(kāi)發(fā)利用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供借鑒,并為四川花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。